内生真菌Epicoccum italicum HE20调控小麦长链非编码RNA表达以增强对条锈病抗性的机制研究

《Physics of Life Reviews》：Uncovering differential expressed long non-coding RNAs of wheat in response to the endophyte Epicoccum italicum HE20 and yellow rust infection

本研究聚焦小麦条锈病（由Puccinia striiformis f. sp. tritici引起）的生物防治难题，通过分析内生真菌Epicoccum italicum HE20（E. italicum HE20）与病原菌互作下小麦长链非编码RNA（lncRNA）的差异表达谱，发现E. italicum HE20可显著降低病害严重度（从92.5%降至12.0%），并鉴定出68个关键lncRNA。这些lncRNA通过调控蛋白酶活性、光合作用及氧化还原等通路，形成复杂互作网络（如TAES_LNC028417.1通过吸附miR393家族增强免疫），揭示了内生真菌通过lncRNA介导的分子网络增强小麦抗病性的新机制，为作物抗病育种提供新靶点。

　　

小麦是全球最重要的粮食作物之一，尤其在埃及等国家，小麦的生产直接关系到粮食安全。然而，小麦生产常常受到多种真菌病害的威胁，其中由条形柄锈菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici）引起的条锈病尤为严重，可能导致作物完全绝收。传统化学防治方法虽然有效，但长期使用会带来环境污染和病原菌抗药性问题。因此，开发环境友好、可持续的生物防治策略成为当前研究的热点。内生真菌（endophyte）作为一种与植物共生且对宿主无害的微生物，在生物防治中展现出巨大潜力。例如，先前研究发现，从小麦健康植株中分离的内生真菌Epicoccum italicum HE20能显著降低条锈病的严重程度，但其分子机制尚不明确。长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸、不编码蛋白质的RNA分子，近年来被发现在植物应对生物和非生物胁迫中扮演关键调控角色。然而，由于lncRNA序列保守性低、表达量较低，其功能研究仍面临挑战。为此，本研究通过高通量测序技术，系统分析了小麦在接种E. italicum HE20和条锈病菌后lncRNA的表达变化，旨在揭示内生真菌调控小麦免疫反应的分子网络，为小麦抗病育种提供新的理论依据。该研究发表在《Physics of Life Reviews》杂志。

本研究主要应用了温室控制实验、下一代测序（NGS）技术和生物信息学分析。研究人员在温室中设置了对照（C）、单独接种内生真菌（E）、单独接种条锈病菌（P）以及同时接种两种真菌（E+P）共4个处理组，每个处理3次重复。接种后第3天采集叶片样本，使用miRNeasy Mini Kit提取总RNA，并通过Qubit、NanoDrop和Agilent Bioanalyzer进行质量检测。利用TruSeq? Small RNA Library Prep Kit构建文库，在Illumina MiSeq平台上进行测序。原始数据经FastQC和MultiQC质控后，使用cutadapt去除接头序列，再通过bowtie2将清洁序列比对到小麦参考基因组，并用FeatureCounts进行lncRNA计数。差异表达分析通过R软件的limma包完成，以错误发现率（FDR）<0.05和|log₂FC|≥1为阈值筛选显著差异表达的lncRNA。此外，通过PLncDB数据库预测lncRNA的靶基因，并利用agriGO进行基因本体（GO）富集分析。

3.1. 不同处理对病害严重度的影响

接种种条锈病菌的小麦植株病害严重度和平均感染系数均高达92.5%，而同时接种E. italicum HE20的处理组显著降低至12.0%和5.0%，表明E. italicum HE20对条锈病具有显著防治效果。

3.2. 数据探索

主成分分析（PCA）显示，PC1和PC2共同解释了94.7%的方差，其中P处理与其他处理明显分离，表明条锈病菌感染引发了独特的lncRNA表达模式。E+P处理也呈现独立聚类，提示内生真菌与病原菌互作可能激活特异性转录调控网络。

3.3. 差异表达分析

共鉴定出68个显著差异表达的lncRNA。热图分析将这些lncRNA分为4个簇：簇1（蓝色）在E和E+P处理中上调，在P处理中下调；簇2（灰色）主要在E+P处理中上调；簇3（橙色）在P处理中强烈上调；簇4（红色）在E+P处理中下调。火山图进一步显示，E+P处理中lnc30、lnc67、lnc62等显著上调，而P处理中lnc27、lnc43等上调，lnc26、lnc9等下调。

3.4. lncRNA-基因互作网络

构建的互作网络包含70个节点，其中TAES_LNC024506.1、TAES_LNC009986.1等lncRNA呈现多连接特性，可能作为调控枢纽。例如，TAES_LNC028417.1与多个蛋白编码基因及Tae-miR393家族成员互作，暗示其可能通过竞争性内源RNA（ceRNA）机制调控免疫通路。

3.5. lncRNA互作网络

TAES_LNC019152.1在条锈病菌感染后上调，并与4个lacRNR同源基因互作，可能参与次生代谢物合成。TAES_LNC019060.1作为核心节点，与超过100个靶基因相连，表明其具有广泛的调控影响力。

3.6. 基因集富集分析

GO富集分析显示，靶基因显著富集于分子功能（如半胱氨酸型内切肽酶抑制剂活性、铁离子结合）、细胞组分（如光系统I、类囊体）和生物过程（如光合作用、氧化还原过程），表明这些lncRNA通过调控防御相关通路增强小麦免疫。

本研究通过整合转录组学和网络分析，系统揭示了E. italicum HE20通过调控小麦lncRNA表达增强对条锈病抗性的分子机制。研究发现，E. italicum HE20接种不仅能直接抑制病原菌，还能诱导一系列关键lncRNA（如TAES_LNC028417.1和TAES_LNC019060.1）的表达，这些lncRNA通过ceRNA机制、转录调控或染色质修饰等方式，广泛影响防御基因网络。例如，TAES_LNC028417.1通过吸附Tae-miR393家族成员，可能缓解其对靶基因的抑制，从而增强水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）信号通路，激活系统获得性抗性（SAR）。同时，GO富集结果进一步证实了lncRNA在蛋白酶抑制、铁离子螯合及光合作用等生理过程中的核心地位，这些过程共同构成了小麦应对病原侵袭的多层次防御体系。该研究不仅阐明了内生真菌与宿主互作的新机制，还为作物抗病育种提供了潜在的lncRNA靶点，有望推动基于RNA调控的绿色防控策略发展。