CaCl2与高温处理结合使用，通过抑制乙烯的生物合成和细胞壁的降解，延缓了苹果果实的软化过程

《Postharvest Biology and Technology》：CaCl 2 combined with high-temperature treatment delays softening in apple fruit through suppressing the ethylene biosynthesis and cell wall degradation

苹果果实软化延缓机制研究：CaCl?联合高温通过抑制MdWER-like转录激活因子和促进MdHSFB-3-like热休克因子表达，调控乙烯合成基因MdACS1及细胞壁降解基因MdEXPA6、MdPG1的表达，抑制多酚氧化酶活性并减少果胶降解。

　　在水果的成熟与软化过程中，果实的质地是影响其食用品质、消费者偏好和储存寿命的关键因素之一。软化作为果实品质下降的重要表现，通常伴随着细胞壁成分的分解和结构的破坏。研究者们长期致力于探索抑制果实软化的方法，以延长其货架期并提高经济价值。在众多方法中，钙盐（如氯化钙CaCl?）与高温处理的组合被证明能够有效延缓苹果果实的软化过程。然而，这种处理方式对果实软化的具体分子机制尚未完全明确。

### 1. 果实软化的生理与分子基础

果实软化主要涉及细胞壁的降解，这一过程由多种细胞壁降解酶协同作用完成。这些酶包括果胶酶（PG）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）、果胶酯酶（PME）、纤维素酶（CEL）、聚半乳糖醛酸酶（PL）、β-葡萄糖苷酶（β-Glu）以及膨胀素（EXP）等。它们的活性与果实软化速度密切相关，因此，调控这些酶的表达或活性是延缓果实软化的重要策略。此外，乙烯作为一种关键的植物激素，在果实成熟和软化过程中起着调控作用。乙烯的合成依赖于一系列酶，如1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶（ACS）和1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶（ACO）。研究表明，外源乙烯处理能够加速如香蕉、桃、苹果和梨等呼吸跃变型果实的软化过程。因此，抑制乙烯的合成与信号传导，是延缓果实软化的另一重要途径。

在苹果果实的软化过程中，某些转录因子（Transcription Factors, TFs）被发现与细胞壁降解和乙烯合成相关。例如，R2R3型MYB转录因子MdWER-like被证实能够激活与乙烯合成相关的基因，如MdACS1，以及与细胞壁降解相关的基因，如MdEXPA6。而热休克转录因子（HSF）则可能在抑制某些基因表达方面发挥关键作用，例如通过调控MdPG1的表达来减缓果实软化。这些转录因子与细胞壁降解酶和乙烯合成相关基因之间的相互作用，构成了果实软化调控的复杂网络。

### 2. 氯化钙与高温处理的协同效应

氯化钙作为一种常用的保鲜剂，已被广泛应用于果蔬的贮藏过程中。其作用机制包括增强细胞壁的结构稳定性、抑制细胞壁降解酶的活性以及调节乙烯的合成与释放。然而，单独使用氯化钙对果实软化的抑制效果有限，因此研究者们尝试将其与高温处理相结合。研究表明，这种组合处理能够显著延缓苹果果实的软化过程，具体表现为果实硬度的维持、乙烯释放的抑制以及细胞壁降解相关酶活性的降低。

在实验中，苹果果实被分为四个处理组：对照组、2% CaCl?处理组、38°C高温处理组以及2% CaCl?+38°C组合处理组。经过25天的贮藏后，组合处理组的果实硬度明显高于对照组，分别为70.30 N和53.36 N。同时，乙烯的释放量也显著减少，表明氯化钙与高温处理共同作用，能够有效抑制果实成熟过程中的乙烯合成。此外，组合处理还显著降低了可溶性果胶的含量，维持了果实的细胞壁结构完整性，从而延缓了软化过程。

### 3. 转录因子MdWER-like与MdHSFB-3-like的调控作用

在分子层面，研究发现CaCl?与高温处理能够显著调控两个关键的转录因子：MdWER-like和MdHSFB-3-like。MdWER-like被证实为一种转录激活因子，能够促进MdACS1和MdEXPA6基因的表达，从而加速乙烯合成和细胞壁降解，导致果实软化。而MdHSFB-3-like则作为一种转录抑制因子，通过抑制MdPG1的表达，减缓果胶的分解，进而延缓果实软化。这种调控机制可能是氯化钙与高温处理协同作用的关键所在。

通过双荧光素酶报告基因实验和酵母单杂交（Y1H）分析，研究人员进一步验证了这些转录因子对相关基因的调控作用。实验结果显示，MdWER-like能够直接结合MdEXPA6和MdACS1的启动子区域，促进其转录；而MdHSFB-3-like则结合MdPG1的启动子，抑制其表达。这些结果表明，MdWER-like和MdHSFB-3-like在果实软化过程中扮演着相反的角色，前者促进软化，后者抑制软化。

### 4. 细胞壁降解与果实软化的相互关系

细胞壁的降解是果实软化的直接原因，因此，调控细胞壁降解相关基因的表达是延缓果实软化的有效手段。在苹果果实中，MdPG1是参与果胶分解的关键基因，其表达水平与果实软化程度密切相关。研究发现，CaCl?与高温处理能够显著降低MdPG1的表达，从而减少果胶的降解，维持果实硬度。此外，这些处理还能够抑制其他细胞壁降解酶（如PG、CEL、β-Glu和PL）的活性，进一步延缓果实软化。

在实验中，研究人员通过苹果愈伤组织的转基因实验验证了这些调控机制。当MdHSFB-3-like被过表达时，其能够显著降低MdEXPA6和MdPG1的表达，从而抑制细胞壁降解酶的活性，减少可溶性果胶的生成，提高果实硬度。相反，当MdWER-like被过表达时，其促进MdEXPA6和MdACS1的表达，导致果胶分解加速和乙烯合成增加，从而加快果实软化过程。这表明，MdWER-like和MdHSFB-3-like在果实软化过程中起着相反的调控作用，它们的协同作用可能决定了果实的最终软化程度。

### 5. 钙信号通路在果实软化调控中的作用

钙离子（Ca2?）在果实成熟和软化过程中发挥着重要的信号传导作用。研究表明，Ca2?能够通过激活钙依赖性蛋白激酶（CaMK）等信号通路，调控一系列关键基因的表达。例如，在苹果果实中，Ca2?通过激活MdCDPK7，进而增强MdMADS5的磷酸化，从而抑制MdACS1的表达，减少乙烯的合成。此外，Ca2?还能够通过Ca2?/钙调素（CaM）信号通路，促进MdCRF4的磷酸化，引发其泛素化和降解，进一步降低MdACS1的表达。

这些钙信号通路的调控作用不仅影响乙烯的合成，还通过影响细胞壁降解酶的表达和活性，间接调控果实软化。在CaCl?与高温处理的组合作用下，这些信号通路被进一步激活，从而更有效地延缓果实软化过程。同时，研究还发现，CaCl?能够通过抑制MdWER-like的表达，间接减少MdACS1和MdEXPA6的表达，进而降低乙烯的合成和细胞壁的降解速率。

### 6. 转录因子与果实软化的分子机制

通过RNA-seq分析，研究人员发现CaCl?与高温处理能够显著改变苹果果实中多个转录因子的表达水平。其中，MdHSFB-3-like的表达被显著上调，而MdWER-like的表达则被显著下调。这种表达模式的变化，可能与CaCl?和高温处理对果实软化的调控机制有关。

进一步的双荧光素酶实验和酵母单杂交分析表明，MdHSFB-3-like能够直接结合MdPG1的启动子区域，抑制其表达，从而减少果胶的分解。而MdWER-like则能够结合MdEXPA6和MdACS1的启动子，促进其转录，进而加速乙烯合成和细胞壁降解。这些结果表明，MdHSFB-3-like和MdWER-like在果实软化过程中具有相反的调控作用，它们的表达水平变化可能决定了果实的软化速度。

### 7. 研究的启示与应用前景

本研究揭示了CaCl?与高温处理在延缓苹果果实软化中的分子机制。通过调控关键转录因子（如MdHSFB-3-like和MdWER-like）的表达，这些处理能够有效抑制细胞壁降解酶的活性和乙烯的合成，从而维持果实硬度和延缓软化过程。这一发现为果实保鲜技术的开发提供了新的思路，也为理解果实成熟和软化的分子调控机制提供了重要的理论支持。

此外，研究还表明，钙信号通路在果实软化调控中起着至关重要的作用。通过激活钙依赖性蛋白激酶，钙离子能够调控多个关键基因的表达，从而影响果实的成熟和软化过程。这些发现不仅有助于深入理解果实软化的分子机制，还为开发基于钙信号的保鲜技术提供了新的方向。

### 8. 结论

综上所述，CaCl?与高温处理能够通过调控关键转录因子和相关基因的表达，有效延缓苹果果实的软化过程。MdHSFB-3-like通过抑制MdPG1的表达，减缓果胶的分解；而MdWER-like则通过促进MdACS1和MdEXPA6的表达，加速乙烯合成和细胞壁降解。这些转录因子的协同作用，构成了果实软化调控的重要机制。同时，钙离子通过多种信号通路（如Ca2?/CaM和MdCDPK7）调控这些转录因子的表达，从而影响果实的成熟和软化过程。

本研究的结果不仅为果实软化的分子机制提供了新的见解，还为开发更有效的果实保鲜技术奠定了理论基础。未来的研究可以进一步探索这些转录因子与其他调控因子之间的相互作用，以及钙信号通路在不同果实种类中的普遍性。此外，还可以结合其他环境因素（如湿度、光照等）来优化果实保鲜策略，以实现更高效的果实质量维护和延长货架期。