基于结构虚拟筛选和分子动力学模拟发现靶向SARS-CoV-2 NSP6蛋白的潜在先导化合物研究

《Scientific Reports》：Bioinformatics approach for discovery of potential lead compound of NSP6 of SARS-CoV-2 using structure based virtual screening and molecular dynamics simulations

本研究针对SARS-CoV-2非结构蛋白6(NSP6)这一缺乏晶体结构但至关重要的病毒复制靶点，采用AlphaFold预测其三级结构，通过ZINC20数据库虚拟筛选和分子对接技术，鉴定出8种具有高结合亲和力的潜在抑制剂。经过100 ns分子动力学模拟和MM-PBSA结合自由能计算，发现ZINC-141,457,420、ZINC-075486396和ZINC-018529632三种化合物在RMSD、RMSF、Rg、SASA和氢键形成等指标上表现优异，且符合Lipinski五规则和ADMET特性，为开发抗COVID-19药物提供了新候选。

　　

在全球抗击COVID-19疫情的背景下，科学家们不断探索新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的生命周期关键环节，寻找有效的治疗靶点。非结构蛋白6(Non-Structural Protein 6, NSP6)作为病毒复制转录复合体(replication-transcription complexes, RTCs)的重要组成部分，通过与内质网sigma受体结合参与双膜囊泡(double-membrane vesicles, DMVs)形成，在病毒复制中发挥关键作用。然而，NSP6的三维结构一直未被解析，这严重制约了针对该靶点的药物研发进程。

面对这一挑战，来自埃及赫勒万大学和萨达特城大学的研究团队在《Scientific Reports》上发表了最新研究成果，采用生物信息学方法对SARS-CoV-2 NSP6蛋白进行系统性药物靶点研究。该研究创新性地结合了蛋白质结构预测、表位预测、虚拟筛选和分子动力学模拟等多种计算生物学技术，为抗病毒药物开发提供了新思路。

研究人员采用了几项关键技术方法：首先利用AlphaFold服务器预测NSP6的三级结构，并通过DeepRefiner服务器进行模型优化；接着使用NetCTL 1.2、IEDB MHC-II和ABCpred服务器分别预测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、辅助T淋巴细胞(HTL)和B细胞表位；然后对ZINC20数据库中290多万个类药化合物进行虚拟筛选，通过AutoDock Vina进行分子对接；最后对筛选出的8个候选化合物与NSP6的复合物进行100 ns分子动力学模拟，并采用MM-PBSA方法计算结合自由能。

结构建模与表位预测

研究团队首先通过PSIPRED服务器预测NSP6的二级结构，显示该蛋白由77.93%的α-螺旋、2.76%的β-折叠和19.31%的无规则卷曲组成。随后利用AlphaFold预测的三级结构模型经SAVES服务器验证显示ERRAT得分达99.64%，PROCHECK的Ramachandran图显示94.4%残基位于核心区域，表明模型质量可靠。表位预测结果显示，最终筛选出3个CTL表位、25个HTL表位和5个B细胞表位，为后续疫苗设计提供了基础。

虚拟筛选与分子对接

研究人员对ZINC20数据库中的290多万个化合物进行虚拟筛选，通过AutoDock Vina进行分子对接，最终筛选出8个结合能最优的化合物，其结合能(E_score)范围在-49.64至-43.13 kcal/mol之间。这些化合物均与NSP6的CTL和HTL表位区域残基结合，显示出良好的靶向性。

化合物与蛋白相互作用分析

分子对接结果显示，8个候选化合物与NSP6蛋白形成了稳定的相互作用网络。特别是ZINC-018529632、ZINC-075486396和ZINC-141,457,420表现出最强的结合亲和力。

药物代谢特性与毒性评估

通过Swiss-ADME服务器评估的类药性分析显示，所有8个化合物分子量均小于380 Da，log P值小于5，生物利用度评分高于0.5。其中6个化合物完全符合Lipinski五规则。ProTox III毒性预测表明这些化合物均无心脏毒性、肾毒性、致癌性等不良反应，具有良好的安全性。

分子动力学模拟分析

100 ns分子动力学模拟揭示了各复合物的动态稳定性特征。RMSD分析显示NSP6-ZINC-075484852复合物在10 ns即达到稳定，RMSD维持在0.75 nm左右；而NSP6-ZINC-018529632复合物在四个不同时间段保持稳定。

RMSF分析表明NSP6-ZINC-075486396和NSP6-ZINC-075484852复合物在三个关键区域(30:50、80:100和170:200)均表现出最低的波动性，说明结合后蛋白结构更加稳定。

回转半径(Rg)分析显示所有复合物的Rg值在2.00-2.04 nm之间，与apo蛋白(2.03±0.01 nm)相比变化不大，表明配体结合未显著影响蛋白结构的紧密性。

溶剂可及表面积(SASA)分析进一步证实了复合物的稳定性，各复合物的SASA值与apo蛋白相比无显著差异。

氢键分析显示NSP6-ZINC-141,457,420复合物形成了最多的氢键(16,278个)，最大同时形成6个氢键，表明其具有最强的结合亲和力。

结合自由能计算

MM-PBSA分析显示，NSP6-ZINC-018529632复合物具有最低的结合自由能(-32.78±5.31 kcal/mol)，表明其结合最稳定。除NSP6-ZINC-141,457,420外，其余复合物均以范德华相互作用为主导。

研究结论表明，ZINC-141,457,420、ZINC-075486396和ZINC-01852932三种化合物在分子对接、动力学稳定性和结合自由能等方面表现优异，特别是ZINC-141,457,420形成了最多的氢键相互作用，而ZINC-018529632具有最低的结合自由能。这些化合物均符合类药五规则，无毒性预测风险，且与NSP6的B细胞和T细胞表位区域结合，显示出作为疫苗候选物的潜力。

该研究的创新之处在于首次系统性地对SARS-CoV-2 NSP6蛋白进行了从结构预测到候选化合物筛选的全面计算生物学研究，为后续实验验证提供了可靠的理论基础。与同类研究相比，本研究筛选的化合物在结合亲和力和类药性方面表现更优，特别是与病毒关键表位区域的结合特性，为开发兼具治疗和预防功能的抗COVID-19药物提供了新思路。然而，作者也指出这些候选化合物仍需进一步的体外和体内实验验证，以确认其安全性和有效性。

这项研究展示了计算生物学在药物发现中的强大应用价值，特别是在公共卫生危机时期，能够快速筛选潜在治疗候选物，为传统实验方法提供重要补充。随着AlphaFold等人工智能技术的不断发展，结构生物信息学将在未来药物研发中发挥越来越重要的作用。