指数滚动圆扩增与回文导向的双向链位移扩增相结合，激活miR-155信号通路中的二聚体CRISPR/Cas12a

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Exponential Rolling Circle Amplification Coupled with Palindrome-Directed Bidirectional Strand Displacement Amplification Activation of Dimeric CRISPR/Cas12a in miR-155 Signaling

该研究开发了一种整合了指数环状扩增（E-RCA）和回文导向链位移扩增（P-SDA）的双模块扩增平台，通过双聚体CRISPR/Cas12a系统实现协同切割效应，显著提升miR-155检测灵敏度至6 aM，并具有高特异性，适用于乳腺癌的无创诊断。

　　乳腺癌（Breast Cancer, BC）作为全球女性癌症相关死亡的主要原因，其早期和精准的检测一直是临床研究的重点。近年来，随着分子生物学技术的不断进步，非侵入性诊断方法逐渐成为研究热点。其中，微小RNA（microRNA, miRNA）因其在疾病发生发展中的关键作用，成为具有潜力的生物标志物之一。miR-155作为一种高度保守的miRNA，已在多项研究中显示出其在乳腺癌诊断中的重要价值。然而，传统的检测方法仍存在灵敏度不足、操作复杂、依赖专业设备等问题，限制了其在临床中的广泛应用。

针对上述挑战，研究人员提出了一种新型的集成放大平台，结合了指数型滚环扩增（Exponential Rolling Circle Amplification, E-RCA）与回文导向的链置换扩增（Palindrome-directed Strand Displacement Amplification, P-SDA）技术。这一平台的独特之处在于引入了双链CRISPR/Cas12a系统，使得miR-155的检测能够实现双位点识别和协同切割，从而显著提高检测的灵敏度和特异性。该系统通过设计特定的探针，如磷酸化环形探针（Phosphorylated Padlock Probe, PP）和嵌有回文序列的发夹探针（Palindrome-structured Hairpin Probe, HP），实现了对miR-155的高效捕获与信号放大。

在这一检测系统中，PP探针的两端设计为与miR-155互补，同时包含部分Cas12a内切酶的识别序列。当miR-155与PP探针结合后，PP探针会形成一个环状结构，从而启动E-RCA扩增过程。E-RCA利用了一种切口-复制反馈机制，能够实现指数级产物积累，具有更高的扩增效率和反应动力学。通过E-RCA产生的切口DNA片段作为触发信号，进一步启动P-SDA过程。P-SDA采用了一种经过合理设计的回文发夹探针，通过双向链置换和自启动复制机制，实现对信号的高精度放大。值得注意的是，最终生成的扩增产物中包含两个不同的Cas12a识别位点，使得两个Cas12a-crRNA复合体能够同时被激活。这种双位点结构不仅提高了信号传播的效率，还通过相邻Cas12a单元之间的协同切割，显著加速了生化反应的进程，并增强了荧光输出。

与传统的RCA和SDA技术相比，E-RCA/P-SDA级联体系能够实现信号的协同增强，从而提高检测的灵敏度和特异性。这一方法的检测范围较广，可覆盖从50 aM到50 nM的miR-155浓度，其检测下限甚至低至6 aM，表现出极高的灵敏度。同时，该系统在特异性方面也具有显著优势，能够有效区分miR-155与同源序列和点突变。在实际应用中，该检测方法在血液样本中展现出良好的稳定性，验证了其在癌症诊断中的强大潜力。

在实验设计和材料准备方面，所有高纯度DNA序列均由上海桑尼生物科技有限公司合成并进行定量分析。实验中使用的酶及其对应缓冲液，包括T4 DNA连接酶、Phi29 DNA聚合酶和Nt.BbvCI内切酶，均按照标准操作流程进行配置。T4 DNA连接酶的缓冲液包含Tris-HCl、MgCl?、ATP和DTT等成分，而Phi29 DNA聚合酶的缓冲液则含有Tris-HCl、MgCl?、(NH?)?SO?和DTT等物质。这些缓冲液的配置确保了实验过程中DNA扩增和切割反应的高效进行。

在实际操作中，该系统的工作原理基于对miR-155的特异性识别和信号触发。PP探针与miR-155结合后，形成一个环状结构，从而启动E-RCA扩增。这一过程通过切口-复制反馈机制，使得产物能够指数级增长，同时保持高度的稳定性和可重复性。随后，E-RCA产生的切口DNA片段作为触发信号，启动P-SDA过程。P-SDA利用了回文发夹探针的设计，使得链置换反应能够在两个方向上进行，从而实现信号的进一步放大。最终，生成的扩增产物能够同时激活两个Cas12a-crRNA复合体，实现协同切割和信号传播，从而显著提高检测的灵敏度和特异性。

这一集成放大平台不仅在技术上实现了创新，还在应用上展现出广阔的前景。其通过结合E-RCA和P-SDA两种扩增技术，构建了一个具有双识别位点和协同切割能力的CRISPR/Cas12a系统，使得miR-155的检测能够在较低的浓度下实现高灵敏度和高特异性。同时，该系统的设计考虑到了实际操作的简便性和稳定性，使得其能够在多种生物样本中广泛应用。此外，该平台的可扩展性也为未来的分子诊断研究提供了新的思路和方向。

在研究过程中，研究人员还对系统的各个模块进行了详细优化和验证。例如，PP探针的磷酸化处理能够确保其在形成环状结构时的稳定性，而HP探针的回文序列设计则能够提高链置换反应的效率。这些优化措施使得整个检测流程更加高效，同时也降低了实验操作的复杂性。此外，双链CRISPR/Cas12a系统的引入，使得Cas12a-crRNA复合体的激活效率得到了显著提升，从而实现了更高的信号输出和更快的反应速度。

该平台的广泛应用潜力不仅体现在乳腺癌的检测上，还可能扩展到其他癌症和疾病的诊断。miR-155作为一种高度保守的miRNA，其在多种癌症中的表达变化已被证实，因此该检测方法的适用范围可能远不止于乳腺癌。此外，该平台的设计理念也可以应用于其他生物标志物的检测，为个性化医疗和精准诊断提供了新的技术基础。通过不断优化和改进，这一平台有望成为未来分子诊断技术的重要组成部分。

在研究团队的贡献方面，所有作者均在不同环节发挥了重要作用。Jianguo Xu作为项目的主要负责人，负责研究设计、数据分析、技术开发和资金获取。Zhuqi Sui和Jia Zhao则在实验设计、数据验证和方法优化方面提供了重要支持。Baoqiang Chen和Xiao-ming Meng在数据分析和项目管理方面也做出了贡献。所有研究人员共同推动了这一创新平台的开发，确保了实验的顺利进行和研究结果的可靠性。

该研究的成果得到了多项基金的支持，包括安徽省博士后科研资助计划、嘉兴市科技计划社会发展专项项目以及浙江省自然科学基金。这些资金的投入不仅保障了实验材料的采购和设备的运行，还为研究人员提供了充足的时间和资源，确保了研究的深入进行和成果的高质量产出。此外，该研究还得到了相关科研机构和合作单位的支持，为实验的顺利实施提供了必要的条件。

在技术层面，这一集成放大平台的开发不仅提高了miR-155检测的灵敏度和特异性，还为未来的分子诊断技术提供了新的思路。通过结合E-RCA和P-SDA两种扩增技术，研究人员成功构建了一个具有双识别位点和协同切割能力的CRISPR/Cas12a系统，使得检测能够在更广泛的浓度范围内实现高灵敏度和高特异性。这一系统的成功应用，不仅为乳腺癌的早期诊断提供了新的方法，也为其他疾病的诊断研究提供了可借鉴的模式。

总体而言，这一集成放大平台的开发代表了分子诊断技术的重要进展。通过创新性的技术设计和优化，研究人员成功克服了传统方法在灵敏度和特异性方面的不足，为乳腺癌的早期和精准检测提供了新的解决方案。该平台的广泛应用潜力和可扩展性，使其成为未来分子诊断技术的重要组成部分，为精准医疗和个性化治疗提供了坚实的技术基础。