综述：功能性核酸赋予CRISPR/Cas系统新能力：实现无标记快速检测的新维度

《TrAC Trends in Analytical Chemistry》：Functional Nucleic Acids Empower CRISPR/Cas: A Novel Dimension in Label-Free Rapid Detection

CRISPR/Cas系统与功能核酸（FNAs）结合为无标记检测提供了高效解决方案，突破了传统荧光标记的高成本和背景干扰问题。本文系统综述了G4、G3、aptamers、DNA酶等FNAs在CRISPR检测中的应用，涵盖信号放大机制、纳米结构设计及多模式检测策略。G4通过空间位阻效应实现高稳定性，G3因结构松散具备更高切割灵敏度，两者结合RPA或HCR扩增可检测至aM级。DNA酶如Supernova和Aurora分别实现化学发光和荧光增强，检测限达fM级。DNA水凝胶、纳米线等复杂结构通过拓扑组装实现信号协同放大，灵敏度提升至pg/mL级。技术优势包括无需标记、灵敏度高（达attomolar级）、多模式输出（色度、荧光、电化学等），但面临结构稳定性、批次一致性及成本控制挑战。未来需整合AI优化设计、微流控集成及标准化流程，推动从实验室到临床的转化应用。

　　在现代生物医学领域，CRISPR/Cas系统因其强大的靶向识别能力和高效的核酸酶活性，展现出了在分析检测中的巨大潜力。然而，传统基于荧光标记的CRISPR检测策略仍面临诸如成本高昂和背景信号干扰等固有局限。近年来，将功能性核酸（FNAs）与CRISPR技术相结合，为克服这些挑战提供了创新的解决方案。本文系统地探讨了功能性核酸在构建高灵敏度、低成本的无标记CRISPR生物传感器中的应用，重点介绍了G-四链体（G4）、G-三链体（G3）、适配体（aptamers）、DNA酶（DNAzymes）、DNA水凝胶（DNA hydrogels）、DNA纳米线（DNA nanowires）、DNA折纸（DNA origami）以及DNA四面体（DNA tetrahedra）等多种功能性核酸材料在CRISPR检测系统中的协同作用和信号放大机制。这些功能性核酸通过其独特的结构和催化特性，赋予CRISPR系统更灵敏、更特异、更多样化的信号输出能力。文章还分析了该领域未来的发展机遇与挑战，为功能性核酸与CRISPR技术的进一步融合提供了前瞻性视角。

随着CRISPR技术的不断深入研究，科学家们发现其不仅具有识别特定DNA或RNA序列的能力，还能在激活后表现出显著的非特异性单链核酸降解活性。这一特性使得CRISPR技术成为构建新型核酸检测平台的重要工具，如DETECTR、HOLMES和SHERLOCK等。这些平台巧妙利用CRISPR/Cas系统激活后对荧光标记探针（FQ-ssDNA/FQ-ssRNA）的降解作用，实现荧光信号释放，从而完成信号放大和精准输出。通过精心设计的crRNA，CRISPR/Cas技术能够准确识别并切割目标核酸序列，从而实现对多种生物标志物的高灵敏度和高特异性检测，如核酸、蛋白质和小分子等。该技术具有显著的优势，包括强大的可编程性、出色的多路复用能力以及操作简便，为疾病诊断和食品安全等关键领域提供了创新的分析解决方案。

然而，传统的荧光标记检测方法仍存在一定的局限性，如需要大量共价标记的单链DNA探针，显著增加了检测成本；相对较小的荧光淬灭探针容易在复杂的生物样本中降解，不仅导致信号丢失，还增加了背景值，这在点对点检测（POCT）和资源有限地区应用中构成了制约。因此，开发具有低背景信号、多样化信号输出模式和高性价比的新报告分子成为该领域的一个关键科学挑战。

功能性核酸因其独特的可编程性和对纳米颗粒的良好亲和力，成为构建下一代信号报告探针的理想材料，为生物传感领域注入了新的活力。基于功能性核酸的无标记信号报告探针因其显著的信噪比和成本效益而受到研究者的广泛认可。这些功能性分子不仅能够有效替代传统的蛋白酶和抗体，还开创了生物传感和分析检测的新领域。

在深入探索CRISPR技术的过程中，科学家们发现CRISPR/Cas系统在激活后能够对复杂的DNA结构进行精确的降解。这一重要突破为功能性核酸的应用开辟了新的前景，使其成为CRISPR检测系统中理想的信号传导载体。与传统的共价荧光标记探针相比，功能性核酸表现出独特的优点：其合成过程高效便捷，完全避免了繁琐的标记步骤；其制备成本显著降低，提供了高经济效率；其检测方案灵活多样，表现出强大的适应性。这些优点使功能性核酸在多种检测场景中表现出色，特别是在资源有限环境中，为快速而精确的检测提供了理想的解决方案。功能性核酸与CRISPR技术的结合，推动了生物传感和分子诊断领域的显著进展。这种巧妙的组合不仅实现了无标记检测的突破，还提升了检测的灵敏度和特异性。随着该领域的不断深入，功能性核酸将在未来生物医学检测的发展中扮演越来越重要的角色，保障人类健康。

近年来，CRISPR技术与功能性核酸的战略性整合成为解决传统荧光标记检测系统局限性的有效途径。本文系统地探讨了多种功能性核酸在构建高灵敏度和低成本的CRISPR无标记检测平台中的创新应用。这些功能性核酸包括G-四链体（G4）、G-三链体（G3）及其各种结构变体、适配体（DNA和RNA）、DNA酶（传统和新型变体）、DNA水凝胶（化学交联、酶促放大和序列杂交组装）、DNA纳米线、DNA折纸和DNA四面体等。通过其独特的三维结构配置和内在的催化活性，这些功能性核酸为CRISPR系统提供了增强的灵敏度（检测限达到飞摩尔至阿摩尔级别）、改善的目标特异性以及多样化的信号输出能力，涵盖比色法、荧光法、电化学法、化学发光法和光热检测模式。本文重点介绍了该领域近期的技术进展，提供了对不同功能性核酸与CRISPR系统协同作用机制的详细机制分析，包括不同Cas蛋白（Cas9、Cas12a/b、Cas13a/b、Cas14）的顺式和反式切割活动。我们系统总结了当前的研究成果，突出了从实验室概念验证到实际应用的成功过渡，并全面分析了其在临床诊断、精准医学、食品安全检测、环境监测和资源有限地区点对点检测中的广阔应用前景。此外，我们还客观评估了当前的机会，如与人工智能和智能手机检测平台的集成，以及持续存在的挑战，包括复杂生物基质中的结构稳定性、批次间的可重复性、广泛采用的经济障碍、临床转化的监管框架以及标准化协议的开发。

CRISPR/Cas系统是基于细菌和古菌的适应性免疫机制开发出的可编程核酸切割工具，其在生物检测中的潜力日益凸显。根据效应模块的不同，CRISPR/Cas系统可分为两大类：第一类和第二类。第一类包括I、III和IV型系统，而第二类包括II、V和VI型系统。两类系统的主要区别在于其效应复合物的组成：第一类系统使用由功能不同的蛋白质组成的多亚基复合物，而第二类系统依赖于单一的多功能效应蛋白。在生物检测应用中，第二类CRISPR/Cas系统更为常见，因其结构相对简单且操作便捷，其中最突出的是Cas9效应蛋白。

在深入研究CRISPR技术的过程中，科学家们发现CRISPR/Cas系统在激活后对复杂DNA结构的精确降解能力。这一重要发现为功能性核酸的应用开辟了新的前景，使其成为CRISPR检测系统中理想的信号传导载体。通过这种独特的特性，功能性核酸不仅能够实现更灵敏的信号响应，还能够有效避免传统标记方法中的背景干扰问题。功能性核酸与CRISPR技术的结合，为生物传感和分子诊断领域带来了显著的进展。这种巧妙的组合不仅实现了无标记检测的突破，还显著提升了检测的灵敏度和特异性。随着该领域的持续发展，功能性核酸将在未来生物医学检测中发挥越来越重要的作用，为人类健康提供保障。

功能性核酸在CRISPR检测中的应用展现出多样的创新潜力，不仅限于单一信号传导模式，还能通过不同的结构和催化机制实现信号放大和多路检测。例如，G-四链体（G4）因其独特的四链结构和双功能特性（荧光增强和过氧化物酶样催化活性），在CRISPR无标记检测系统中具有重要的应用价值。通过直接降解G4结构或切割G4反义序列，G4可以实现不同的检测策略，表现出不同的技术特性，如检测灵敏度、操作便捷性和应用范围。G4的结构和催化特性使其成为构建高灵敏度、低成本的无标记CRISPR生物传感器的理想材料。

为了克服传统G4结构在CRISPR检测中的技术挑战，如切割效率和背景信号干扰，研究人员通过化学修饰、结构重组和预处理策略开发了多种G4变体，以优化检测性能并拓展应用范围。这些变体技术通过不同的结构调控机制，实现了检测策略的优化，同时保持了G4的核心功能特性。例如，通过引入磷硫键修饰，G4结构的稳定性得到了显著提升，同时避免了非特异性核酸酶降解，从而实现了高效的信号输出。此外，通过构建模块化的G4结构，研究人员能够实现更灵活的信号调控，提升检测的精确度和灵敏度。

G-四链体的结构和功能特性使其在CRISPR无标记检测系统中展现出独特的应用潜力。通过化学修饰、结构重组和预处理策略，G4变体能够有效克服传统G4结构在检测中的技术瓶颈，如切割效率和背景信号干扰。这些策略通过优化G4结构的稳定性，使其在复杂的生物环境中保持良好的检测性能。此外，G4的模块化设计和可编程特性使其能够适应不同的检测需求，为构建多功能的CRISPR检测平台提供了技术基础。

功能性核酸不仅在G-四链体和G-三链体结构中表现出色，在适配体和DNA酶等其他类型的分子检测中也展现出显著的优势。例如，适配体能够通过其特定的分子识别能力，实现对目标分子的高灵敏度检测，同时通过催化活性增强信号输出，避免复杂的化学标记步骤。DNA酶则能够通过其独特的催化特性，为无标记检测提供高效的信号放大机制。这些功能性核酸材料的结合，不仅提升了CRISPR检测的灵敏度和特异性，还为构建高效的生物传感平台提供了技术基础。

此外，DNA水凝胶、DNA纳米线和DNA折纸等高级结构也展现出在无标记检测中的独特优势。DNA水凝胶通过其三维网络结构，能够实现对目标分子的响应式信号传导，同时通过多种检测模式（如比色法、荧光法、电化学法）提升检测的多样性和灵敏度。DNA纳米线则通过其独特的结构和功能特性，实现了对目标分子的高灵敏度检测，同时通过多步信号放大机制提升了检测的准确性。DNA折纸技术则通过精确的三维结构设计，实现了对目标分子的高灵敏度检测，为构建复杂的检测平台提供了新的思路。

在功能性核酸与CRISPR技术的结合过程中，研究者们不断探索新的结构和功能特性，以提升检测性能和应用范围。例如，通过引入更复杂的结构设计，如DNA水凝胶的多层结构和DNA纳米线的多维结构，研究人员能够实现更高效的信号传导和检测。此外，通过结合不同的信号放大策略，如G-四链体的多组分结构和DNA酶的多级级联放大机制，功能性核酸在无标记检测中的应用不断拓展。

然而，功能性核酸在CRISPR检测中的应用仍面临一些挑战，如结构稳定性、批次间的一致性、经济成本和监管框架等。这些问题需要通过进一步的技术优化和系统设计来解决。例如，通过引入更稳定的化学修饰策略，如磷硫键修饰，可以提升功能性核酸在复杂生物环境中的稳定性。此外，通过优化合成工艺和检测流程，可以降低功能性核酸的制备成本，提高检测的可重复性和一致性。

功能性核酸与CRISPR技术的结合，为生物传感和分子诊断领域带来了新的发展机遇。这种技术不仅提升了检测的灵敏度和特异性，还为构建高效、低成本的无标记检测平台提供了新的思路。通过持续的技术创新和系统优化，功能性核酸在CRISPR检测中的应用前景广阔，有望在未来的生物医学检测中发挥更大的作用，为人类健康和疾病诊断提供重要的技术支持。