综述：用于分子印迹聚合物实际应用的脒盐桥

《TrAC Trends in Analytical Chemistry》：Amidinium salt bridges for real-world applications of molecularly imprinted polymers

这篇综述系统阐述了脒盐桥在分子印迹聚合物（MIPs）中的关键作用，重点介绍了Wulff开创的基于强盐桥相互作用（如脒-磷酸盐/膦酸盐复合物）的化学计量非共价印迹策略。文章详述了从催化MIPs（模拟羧肽酶A）到水相容性MIPs（用于汗液、尿液等复杂环境中靶标检测）的演进，强调了脒（amidine）及相关胍（guanidine）单体在实现高亲和力、高特异性识别中的优势，为MIPs在生物传感、疾病诊断和治疗等领域的实际应用提供了重要见解。

　　

1. 引言

脒基和胍基是强碱性基团，其水溶液中的pK_a值分别高达12.4和13.6。这种高碱性源于质子化后形成的共振稳定阳离子，其有效的网络共轭效应使其在可逆条件下保持稳定。由于高pK_a值，脒鎓和胍鎓阳离子在很宽的pH范围内都能保持质子化状态，尤其重要的是，它们能在生理pH下与含氧阴离子底物形成盐桥。

盐桥是一种非共价相互作用，当阳离子氢键供体（如脒、胍）与阴离子氢键受体（如羧酸根、磷酸根、膦酸根、硫酸根）相互作用时，同时涉及氢键和离子配对。Günter Wulff在20世纪90年代末将脒鎓-羧酸根、脒鎓-磷酸根和脒鎓-膦酸根盐桥引入分子印迹技术，提出了化学计量非共价相互作用的概念。他的团队合成了大量可聚合的脒类化合物，其中N,N'-二乙基-4-乙烯基苯甲脒在氘代乙腈中与羧酸根、磷酸根和膦酸根能 readily 形成化学计量非共价相互作用，结合常数（K_a）分别达到1.2 × 10⁴ M^-1、4.6 × 10³ M^-1 和 8.7 × 10³ M^-1。作为对比，典型的氢键结合常数要低得多，例如甲基丙烯酸与苯丙氨酸苯胺或双酚A的1:1复合物在相似条件下的K_a分别仅为30 M^-1和0.05 M^-1。

2. 用于印迹过渡态类似物的脒类化合物

催化分子印迹聚合物（MIPs）以及通过印迹反应过渡态类似物（TSA）来获得具有酶样特异性和活性的MIPs的策略，最初由Mosbach及其同事开创，但Wulff及其同事发展并推动了这项研究的可见度。Wulff使用含有磷酸基团和膦酸基团的模板分子作为TSA，并以N,N'-二乙基-4-乙烯基苯甲脒作为功能单体进行化学计量印迹。

一个杰出的例子是模拟羧肽酶A的催化MIP。该MIP的活性位点设计模仿了酶中Arg127的胍基 moiety，使用脒鎓基团作为功能单体。此外，该单体还包含一个Cu²⁺离子结合位点，用于稳定其三亚胺部分与TSA分子吡啶氮形成的复合物，从而提供明确的复合物取向以及金属离子催化作用。TSA分子的四面体几何结构磷酸酯官能团模拟了碳酸酯水解过渡态的四面体几何结构。由于对反应过渡态的稳定作用，碳酸酯底物的水解得到增强，该MIP表现出典型的米氏动力学，其转换数（k_cat）达到2.86，远高于非印迹聚合物（NIP）的0.035。催化活性以k_cat/k_uncat（k_uncat = k_solution）比值表示，高达15700，显著超过了针对相同碳酸酯水解功能的催化抗体的效率（k_cat/k_uncat = 810）。印迹因子（MIP与NIP的催化活性之比）高达76.9，MIP催化剂的效率k_cat/K_m比含有相同功能基团的NIP对照聚合物高出537倍，清楚地表明了非常高效的印迹过程。

为了克服传统本体聚合产生的 insoluble 颗粒的局限性，该团队开发了一种称为"后稀释聚合"的新方法，用于制备可溶的、高度交联的、单分子催化纳米凝胶。该催化系统由N,N'-二乙基-4-乙烯基苯甲脒作为功能单体，二苯基磷酸酯作为TSA组成，以模拟水解酶对碳酸酯底物的催化机制。聚合在单体高浓度下开始，以 favor 非共价键复合物的形成和致密颗粒的产生，并在宏观凝胶化之前通过加入聚合溶剂环戊酮进行稀释以终止反应，使浓度低于临界单体浓度（C_M）。所得MIP纳米凝胶表现出米氏动力学，k_cat/k_uncat比值为2990。电子显微镜图像显示纳米凝胶呈球形，直径在10到20纳米之间。分析表明这些可溶的交联纳米凝胶分子量为39 kDa，平均每个颗粒含有一个催化位点，接近天然酶的特征。

3. 用于印迹小分子的脒类化合物

Wulff的N,N'-二乙基-4-乙烯基苯甲脒单体也被用于制备以光学活性二羧酸为模板的手性印迹聚合物。由于印迹空腔的不对称形状，模板比其对映体更容易嵌入其中，因此印迹聚合物能够在四氢呋喃中区分模板的对映体，而在水溶液中，参考聚合物对两种对映体没有显示出差异。

后来的研究使用了N-丙烯酰基-4-氨基苯甲脒醋酸盐（AB），这是Wulff脒单体的一种未取代版本，用于制备针对带有羧基的小分子和肽的MIPs。AB在极性有机溶剂（如DMSO、乙醇）以及磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中均可溶，这使得可以在水相环境中进行肽和蛋白质的印迹。

AB被用于合成针对D-葡萄糖醛酸（GlcA）和N-乙酰-D-神经氨酸（NANA）的MIPs，并应用于人角质形成细胞上透明质酸（HA）和唾液酸的双重生物成像。透明质酸是哺乳动物细胞胞外基质中的一种线性糖胺聚糖，由GlcA和N-乙酰-D-葡萄糖胺交替单元组成。唾液酸是神经氨酸的N-和O-衍生物的统称，其中最常见的成员是NANA，主要位于糖蛋白和糖鞘脂的N-和O-聚糖末端。由于NANA和HA的糖基化水平和分布改变是感染和恶性肿瘤等病理状况的指标，基于荧光标记MIPs的成像剂可用于其检测和定位。这两种MIPs均使用化学计量的AB和过量的甲基丙烯酰胺（提供氢键网络）在DMSO中制备。结合实验表明，两种MIPs对其模板单糖均具有选择性，在竞争性结合实验中未观察到与其他糖类的交叉反应。因此，用绿色荧光的MIP_GlcA-量子点（QD）染色可以选择性地定位HA，而红色荧光的MIP_NANA-QD可以定位唾液酸化位点，或者可以同时进行双重标记。

在另一个例子中，使用了两当量的AB与一个二羧酸（N_α-己酰基谷氨酸）形成化学计量非共价相互作用，作为通用模板来制备MIPs，用于靶向人汗液中的气味分子前体N_α-3-羟基-3-甲基己酰基谷氨酰胺（cj3H3MH）和N_α-3-甲基-2-己烯酰基谷氨酰胺（cj3M2H）。这些无味的前体被皮肤细菌水解后产生有味的脂肪酸。目标是应用MIP作为特异性清除剂来捕获这些前体，从而防止其被细菌水解。合成的MIPs具有良好的生物相容性。当将掺入除臭剂配方中的MIPs在体温下于人汗液中孵育时，它们能够选择性地捕获cj3H3MH和cj3M2H，尽管在这种高度复杂的环境中存在大量其他带有羧基的分子（有些浓度达到mM级别）。这无疑归功于MIP空腔中脒鎓官能团处于有利的空间位置。

4. 用于印迹蛋白质和肽的脒类化合物

4.1. 蛋白质

蛋白质的分子印迹仍然是一个挑战，主要由于其复杂的天然构象需要在聚合过程中得以保持，并且其大尺寸和表面众多官能团使得产生均一的印迹空腔和模板提取变得困难。然而，如果蛋白质能通过使用含有其亲和配体的锚定单体预先固定在特定取向，则聚合可以局限于蛋白质识别位点附近，从而产生选择性MIPs。

以胰蛋白酶为例，它是一种丝氨酸蛋白酶，水解含有精氨酸和赖氨酸残基的底物。苯甲脒是众所周知的竞争性胰蛋白酶抑制剂，通过与底物结合口袋中的Asp189相互作用，以类似于精氨酸的方式阻断其蛋白水解功能。研究团队合成了N-甲基丙烯酰基-4-氨基苯甲脒，用于在磷酸盐缓冲液中通过沉淀聚合法制备MIP微凝胶，其中苯甲脒单体作为强锚定单体，将生长的聚合物链吸引至模板蛋白周围。所得微凝胶能选择性结合胰蛋白酶，而非其他大小和分子量相似的蛋白质，并且表现出竞争性抑制活性，抑制常数（K_i）为79 nM，比小分子竞争性抑制剂苯甲脒的效力高出近三个数量级。

为了实现对胰蛋白酶的快速检测，进一步利用N-丙烯酰基-4-氨基苯甲脒（AB）制备了MIP纳米凝胶（MIP-NGs），用于传感人尿液中的胰蛋白酶。该策略利用了AB与胰蛋白酶结合时荧光增强的特性。通过固相合成法，将胰蛋白酶通过其表面组氨酸残基固定在Cu²⁺-亚氨基二乙酸功能化的玻璃珠（GBs）上，使其活性位点游离以便与AB的苯甲脒部分结合。聚合混合物包含N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（BIS），在磷酸盐缓冲液中于高稀释条件下进行聚合，以获得纳米颗粒。聚合在37°C（高于pNIPAM的低临界溶解温度LCST）下进行，使得生长的聚合物纳米颗粒在塌陷状态下包裹固定化的蛋白质。聚合后，在37°C下洗涤GBs以去除未反应试剂和远离固定模板聚合的低亲和力聚合物。然后，将GBs冷却至4°C（低于pNIPAM的LCST），使MIP-NGs溶胀并被洗脱出来，且不含模板。这些MIP-NGs（尺寸约70 nm）具有改善的结合位点均一性。当MIP-NGs在280 nm激发时，与胰蛋白酶结合会发生荧光增强，荧光强度与胰蛋白酶浓度成正比。此外，这些MIP-NGs被证明是比沉淀聚合法制备的MIP微凝胶更有效的竞争性抑制剂（K_i = 3.4 nM），并可应用于抑制胰蛋白酶消化诱导的肝细胞外基质裂解和细胞膜破坏，表明其在治疗胰蛋白酶依赖性细胞损伤方面的潜力。

4.2. 蛋白质表位

由于使用全蛋白质作为模板存在局限性（如成本高、稳定性差、结合位点不均一等），受自然界抗体识别蛋白质抗原表位的启发，提出了表位印迹策略。该方法使用蛋白质的一个短表面暴露片段作为模板，生成的MIPs能够识别整个蛋白质。

一个例子是使用肽表位与AB功能单体结合，制备用于识别肾脏损伤分子-1（KIM-1，急性肾损伤的尿液生物标志物）的选择性MIPs。通过计算机理性方法选择了一个具有柔性溶剂暴露环状结构、其三维构象与天然蛋白质中相似且为该蛋白独有的表位。为了模拟表位在天然状态下的环状构象，合成了一个环状模板肽，并在两端添加半胱氨酸用于环化，同时引入一个带有叠氮基团的修饰赖氨酸残基，以便通过点击化学将模板肽固定在炔基化玻璃珠（GBs）上。为了进一步将模板固定在确定的取向上，使用AB与模板肽的谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）侧链提供强的两点锚定，同时使用苯基丙烯酰胺（PAA）通过π-π堆积相互作用补充色氨酸（Trp）和苯丙氨酸（Phe）侧链。聚合在磷酸盐缓冲液中于高稀释条件下进行。尽管有人可能推测AB会与缓冲液中的磷酸根阴离子形成盐桥，但实际上其与-COOH的相互作用更占优势。所得的MIP纳米凝胶（尺寸约50 nm）完全溶于水，并对表位肽和KIM-1蛋白表现出高结合亲和力和选择性。通过饱和转移差和WaterLOGSY核磁共振波谱证实了在MIP纳米凝胶表面存在由模板表位印迹产生的原子级分辨率的特异性结合位点。所有结合位点都位于MIPs表面，有利于快速结合动力学。

在此例中，AB单体提供了两个强且位置恰当的脒基，能够通过盐桥相互作用驱动表位模板以预定向的方式结合。选择性通过PAA的存在得到进一步加强，从而在印迹空腔中提供了多点结合位点。研究表明，AB对于实现MIP结合位点的选择性至关重要，将其从预聚合混合物中省略会导致生成的MIP-NGs没有结合能力。

5. 用于MIPs的胍类单体

胍是比脒更强的碱，其更高的碱性源于其能展示更多共振稳定阳离子。胍鎓基团的正电荷离域在三个氮原子上，精氨酸胍基中的五个氢键供体中有四个可以沿着两个可用的边缘互补双齿含氧阴离子受体。

尽管首个用于MIP制备的胍鎓单体早在1999年就有报道，但与相关的MIPs文献数量有限。N-(3-甲基丙烯酰胺丙基)胍氯化物（GUA）曾被Shea课题组用于制备水溶性丙烯酰胺基聚合物纳米颗粒（无模板），以靶向在生理pH下带负电荷的纤维蛋白原（pI = 5.5）。与由其他带正电荷单体（如伯胺单体APM和季铵盐单体ATC）制备的纳米颗粒相比，GUA聚合物NP对纤维蛋白原表现出更高的亲和力。这种高亲和力归因于胍鎓基团可以与纤维蛋白原上的羧酸根形成两个氢键并进行静电相互作用。APM-NP中的伯胺基只能形成一个氢键加静电相互作用，而ATC-NP中的季铵基不能形成氢键，导致与纤维蛋白原的相互作用相对较弱。GUA-NP对其靶蛋白也表现出更高的选择性，当加入到血浆蛋白混合物中时，能够选择性免疫沉淀纤维蛋白原。

另一个胍基单体，丙烯酰L-精氨酸酰胺盐酸盐（一种可聚合的精氨酸单体），被Resmini课题组频繁用于在DMSO中制备可溶的丙烯酰胺基化学计量分子印迹催化微凝胶和纳米凝胶，对4-硝基苯基-4'-乙酰氨基苯基碳酸酯具有水解活性。其印迹策略与Wulff类似，使用精氨酸单体与过渡态类似物模板的磷酸根诱导盐桥，在活性位点产生对碳酸酯水解具有增强速率的MIP。

此外，还有两种荧光胍基功能单体显示出检测含氧阴离子的潜力。其中一种被 incorporated 到以二氧化硅为核心的MIP壳层中，用于在氯仿和乙腈中选择性检测除草剂草甘膦（GPS）。MIP与GPS-TBA（四丁基铵盐）的结合符合1:1化学计量，在氯仿和乙腈中表现出高的表观结合常数。在两种溶剂中也实现了对其他除草剂的可接受区分。

6. 结论与展望

脒基与含氧阴离子物种（如羧酸根、磷酸根和膦酸根）相互作用。两者之间发展的相互作用基于盐桥，这是静电作用和氢键的结合。它们在极性非质子溶剂（如THF、DMSO、乙腈）和极性质子溶剂（如水、乙醇）中的结合常数非常高（K_a > 10³ M^-1）。脒基单体的普及源于Wulff的"幸运"单体N,N'-二乙基-4-乙烯基苯甲脒，它最初用于合成催化MIPs。随着分子印迹技术的逻辑发展，研究人员开始关注合成用于蛋白质识别的MIPs。有趣的是，苯甲脒是胰蛋白酶的已知抑制剂，这启发了合成可聚合的可溶形式苯甲脒（如N-甲基丙烯酰基-4-氨基苯甲脒）作为锚定单体，以产生用于胰蛋白酶的抑制剂MIPs。

为了生产用于病理蛋白质生物标志物的水溶性纳米级MIPs，研究继续开发基于N-丙烯酰基-4-氨基苯甲脒（一种易于一步合成的水溶性脒单体）的MIP纳米凝胶，用于识别肽和蛋白质内的羧酸根。在这种情况下，MIPs在缓冲液中制备，其识别特性通过与游离肽和蛋白质在缓冲溶液中的平衡结合实验确定。基于脒鎓的MIP纳米凝胶已被用于抑制细胞中的胰蛋白酶消化、人尿液中的传感、细胞上癌症生物标志物的荧光生物成像、作为治疗性抗体破坏肿瘤球体或中和巨噬细胞中的炎症等。结构明确的盐桥相互作用提供了极其明确的几何构型，并通过在印迹过程中将目标分子的关键官能团定位在确定的取向上，有助于构象稳定性和特异性。这些结合位点相互作用对于制备需要在水性或复杂生物介质中选择性结合其靶标的MIPs特别有用，因为在这些环境中，涉及高结合常数的相互作用至关重要。显然，脒基是提高MIPs选择性的关键。

尽管胍基单体的出现晚于Wulff的单体，但其合成方法已有详细报道，大多数易于合成。基于脒鎓的功能单体设计用于磷酸衍生物和羧酸根识别，未来有可能靶向另一类含氧阴离子，如硫酸根和磺酸根衍生物，其中包括硫酸化糖胺聚糖（如肝素、皮肤素、软骨素和角质素硫酸酯），它们是细胞表面丰富的有意义的生理靶标。这些化学计量单体为制造新一代具有改进选择性的MIPs铺平了道路，使其能够在真实的水相环境中操作，并应适用于各种生物技术和生物医学领域。