RNF20通过抑制内皮-间质转化和维持生理性血管分泌信号预防先天性心脏病

《Nature Communications》：Endothelial RNF20 suppresses endothelial-to-mesenchymal transition and safeguards physiological angiocrine signaling to prevent congenital heart disease

本研究针对先天性心脏病（CHD）的发病机制，揭示了组蛋白H2B单泛素化（H2Bub1）连接酶RNF20在心脏发育中的关键作用。研究人员通过单细胞测序、基因敲除模型和分子机制研究，发现内皮细胞中RNF20缺失会通过促进TGF-β信号通路和抑制NRG1等生长因子表达，导致内皮-间质转化（EndMT）异常和心肌细胞增殖受损。该研究不仅阐明了RNF20在心脏发育中的新功能，还为先天性心脏病的诊断和治疗提供了潜在靶点。

　　

心脏形态发生和功能依赖于不同心脏细胞类型之间复杂的通讯交流。然而，它们的协同发育和相互作用如何被协调仍然很大程度上未被探索。先天性心脏病（CHD）作为最常见的出生缺陷之一，其发病机制涉及遗传和表观遗传的复杂相互作用。特别是法洛四联症（TOF）等紫绀型先天性心脏病，表现为慢性缺氧和右心室压力超负荷，共同驱动心脏结构、功能和细胞信号的深刻改变。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，研究人员发现组蛋白H2B单泛素化（H2Bub1）连接酶RNF20在心脏发育中扮演着关键角色。通过对TOF患者的单细胞RNA测序分析，他们发现心脏内皮细胞中RNF20表达显著降低，且与氧饱和度呈正相关，与TGF-β信号通路的关键组分和下游效应物表达呈负相关。

为了深入研究RNF20在心脏发育中的功能，研究团队采用了多种关键技术方法：利用Isl1-Cre和Cdh5-CreERT2小鼠模型进行内皮特异性基因敲除；通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析胚胎心脏细胞的转录组变化；使用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析H2Bub1和RNA聚合酶II（Pol II）的基因组分布；建立体外共培养系统研究内皮细胞与心肌细胞的相互作用；并对人类TOF患者样本（来源：GSE203274和GSE305562数据集）进行生物信息学分析。

研究结果揭示了多个重要发现：

Fig.2| Defects in SHF development upon Rnf20 ablation in IsIl+ cardiovascular progenitors

研究人员发现Rnf20在第二心区（SHF）祖细胞中高表达，条件性敲除Rnf20导致胚胎致死，心脏表现出流出道分隔缺陷、右心室发育不全和心律异常。组织学分析显示心肌变薄、小梁发育不良和心内膜紊乱。

Fig.3| Conditional deletion of Rnf20 in IsIl-derived cells alters cardiac cellular composition

单细胞转录组分析显示，Rnf20缺失导致心脏细胞组成发生显著变化，包括心肌细胞群体减少、间质细胞群体增加。特别值得注意的是，内皮/心内膜细胞中Rnf20表达显著降低。

Fig.4| Endothelial RNF20 is essential for heart development and function

内皮特异性敲除Rnf20导致相似的心脏表型，包括心律异常、心室壁变薄和心肌细胞增殖减少。移植实验表明这些表型是内皮细胞自主性的。

Fig.5| Endothelial Rnf20 loss results in defects in EC differentiation and ven-tricular CM proliferation

进一步的单细胞分析证实Rnf20缺失导致增殖性心室心肌细胞显著减少，而心房心肌细胞数量增加，表明内皮Rnf20在心室心肌细胞增殖中具有重要的空间特异性功能。

Fig.6| Endothelial RNF20 inhibits EndMT

研究发现Rnf20抑制内皮-间质转化（EndMT）。Rnf20缺失的内皮细胞表现出迁移能力增强、管形成能力减弱，这是EndMT的两个典型特征。机制上，RNF20沉默导致SMAD2/SMAD3磷酸化增加。

Fig.7| Endothelial RNF20 regulates cardiomyocyte contractility and rhyth-micity

共培养实验证明，RNF20缺失的内皮细胞导致心肌细胞收缩幅度和频率降低，以及节律异常，同时心肌细胞增殖减少。

Fig.8| Rnf20-dependent EC-derived factors regulate CM proliferation

配体-受体相互作用分析发现，Rnf20缺失导致Nrg1、Nrp1、Igf1和Igf2等促进心肌细胞增殖的血管分泌因子减少，而Nppa、MIF、Tgfb1/2以及多种胶原蛋白表达增加。

Fig.9| Rnf20-dependent EC-derived factors regulate CM contractility

功能分析显示，沉默SMAD2和SMAD3可改善RNF20缺失内皮细胞共培养的心肌细胞收缩功能，而NPPA过表达或MIF过表达诱导明显的心律失常搏动模式。

Fig.10| RNF20 restrains Pol II pause release at TGF-β targets, while promoting growth factor gene expression via H2Bub1

机制研究表明，RNF20通过不同的分子机制调控生长因子基因和TGF-β信号通路基因：对于生长因子基因（如NRG1、IGF2），RNF20通过催化H2Bub1促进其转录延伸；对于TGF-β通路基因，RNF20通过阻止TFIIS结合，抑制Pol II暂停释放，从而限制其转录。

研究结论和讨论部分强调，RNF20通过维持TGF-β与生长因子信号之间的关键平衡，在心脏内皮细胞中发挥核心作用，确保适当的心脏发育和功能。RNF20缺失导致TGF-β信号增强，这是诱导EndMT和心脏垫形成的关键因素，同时生长因子信号（如NRG1）减少，导致心肌细胞增殖受损。

这项研究的重要意义在于：首先揭示了RNF20在维持内皮细胞身份和防止异常间质转化中的新功能；其次阐明了RNF20通过不同的转录调控机制协调不同信号通路的独特机制；最后提供了表观遗传调控在先天性心脏病中作用的直接证据，为未来开发针对RNF20-TGF-β轴的治疗策略提供了理论基础。

值得注意的是，RNF20水平在缺氧条件下显著降低，且与TOF患者氧饱和度呈正相关，这表明RNF20可能在连接缺氧信号与心脏发育异常中扮演重要角色。研究人员发现的关键调控机制和信号通路为理解先天性心脏病的分子机制提供了新的视角，也为未来开发新的诊断和治疗方法提供了潜在靶点。