空间N-聚糖重排调控α5β1整合素构象开关——Galectin-3寡聚化决定内吞命运的新机制

《Nature Communications》：Spatial N-glycan rearrangement on α5β1 integrin nucleates galectin-3 oligomers to determine endocytic fate

本研究揭示了整合素构象变化通过空间N-聚糖重排调控Galectin-3寡聚化的新机制。研究人员发现α5β1整合素的弯曲闭合构象可特异性排列N-聚糖，促使Galectin-3形成二聚体至四聚体，进而通过GL-Lect途径介导内吞和逆行运输。该发现为理解糖基化动态调控膜蛋白功能提供了新视角，对纤维化疾病治疗具有潜在意义。

　　

在细胞生命活动的精密调控中，膜蛋白的构象变化如同分子开关，精确控制着细胞与环境的相互作用。整合素作为重要的跨膜糖蛋白，其构象在弯曲闭合（非活性）和伸展开放（活性）状态间的转换，直接影响细胞粘附、迁移等关键生理过程。然而，一个长期悬而未决的科学问题是：为何只有特定构象的整合素能够被选择性内吞并定向运输？近年研究发现，糖基化修饰和凝集素在膜蛋白运输中扮演重要角色，但其中的分子机制仍不清晰。

发表在《Nature Communications》的这项研究，通过多学科技术手段，揭示了整合素构象变化通过空间N-聚糖重排调控Galectin-3寡聚化的精细机制。研究人员发现，α₅β₁整合素的弯曲闭合构象能够将特定N-聚糖精确排列，为Galectin-3的寡聚化提供“ nucleation位点”，从而决定其内吞命运。这一发现不仅阐明了构象特异性内吞的分子基础，还为理解糖基化动态调控膜蛋白功能提供了新范式。

研究团队运用冷冻电镜（cryo-EM）解析了整合素-Galectin-3复合物的高分辨率结构，结合单分子光漂白、微腔悬浮脂质双层等技术，证实了Galectin-3寡聚体的形成及其功能重要性。细胞生物学实验表明，这种构象特异性的糖基化开关调控着整合素的逆行运输和细胞极性分布。

在技术方法上，研究人员首先从大鼠肝脏中纯化天然α₅β₁整合素，并将其重构于纳米盘（nanodiscs）和肽盘（peptidiscs）等人工膜系统中。通过冷冻电镜解析了整合素在不同构象状态下的精细结构，特别是其与Galectin-3形成的复合物。细胞水平上，利用构象特异性抗体（mAb13识别弯曲闭合状态，9EG7识别伸展开放状态）追踪整合素的内吞和运输过程。同时，结合晶格光片显微镜（lattice light sheet microscopy）实时观察分子动态相互作用，并通过交联质谱确定了Galectin-3与整合素的相互作用界面。

Retrograde trafficking of inactive bent-closed α₅β₁ integrin depends on Gal3

研究发现，只有非活性弯曲闭合状态的α₅β₁整合素能够通过Galectin-3依赖的途径进行逆行运输至高尔基体。使用Galectin-3抑制剂I3可显著抑制这一过程，而外源添加Galectin-3则能促进逆行运输。值得注意的是，网格蛋白（clathrin）耗竭不仅不抑制，反而增强了这种逆行运输，表明该过程独立于经典的网格蛋白途径。免疫共沉淀实验进一步证实，弯曲闭合状态的整合素与逆行运输复合体（retromer）组分Vps35和Galectin-3存在特异性相互作用。

Specifically the inactive bent-closed α₅β₁ integrin is internalized by GL-Lect driven endocytosis

通过共定位分析和免疫共沉淀实验，研究人员发现Galectin-3与弯曲闭合状态的整合素在细胞膜和内存结构中存在显著共定位，而这种相互作用依赖于Galectin-3的N端寡聚化结构域。神经氨酸酶处理去除唾液酸后，Galectin-3与弯曲闭合状态整合素的结合进一步增强，但对伸展开放状态的整合素无影响。功能实验表明，弯曲闭合状态整合素的内吞确实依赖于GL-Lect途径，可被Galectin-3抑制剂I3抑制，并被外源Galectin-3促进。

Specifically the inactive bent-closed α₅β₁ integrin nucleates the formation of Gal3 oligomers

在重构的膜系统中，电化学阻抗谱和荧光寿命成像均证实Galectin-3优先结合弯曲闭合状态的整合素。单分子光漂白实验显示，每个整合素分子上可结合最多四个Galectin-3分子。负染电镜分析发现，从弯曲闭合状态整合素上洗脱的Galectin-3可形成环状寡聚体，而从伸展开放状态整合素洗脱的Galectin-3则以单体为主。这种寡聚化过程依赖于Galectin-3的N端结构域，且具有浓度依赖性和可逆性。

Gal3 oligomers are also nucleated on the plasma membrane

令人惊讶的是，从细胞表面洗脱的Galectin-3同样可形成寡聚体，二维分类分析显示存在二聚体（37%）、三聚体（41%）和四聚体（22%）等多种形式。这些预形成的寡聚体比单体具有更强的细胞结合能力，且其结合对N-聚糖的依赖性降低，表明寡聚化增强了Galectin-3与糖缀合物的相互作用能力。

Gal3 oligomers link the head and leg pieces of inactive bent-closed α₅β₁ integrin

冷冻电镜结构解析揭示了Galectin-3寡聚体在整合素上的精确排列方式。在弯曲闭合状态的整合素中，Galectin-3分子桥接于头部和腿部结构域之间，形成“钳制”结构。这种空间排列使得Galectin-3能够同时结合多个N-聚糖，包括α亚基的N356和N918位点。结构分析支持了二聚体、三聚体和四聚体等多种寡聚形式的存在。

Gal3 clamps the inactive bent-closed conformational state of α₅β₁ integrin

功能实验证实，Galectin-3的寡聚化对整合素构象具有稳定作用。预结合Galectin-3可显著抑制Mn²⁺/cRGD诱导的整合素从弯曲闭合向伸展开放的构象转换。这种“钳制”效应依赖于Galectin-3的寡聚化能力，因为缺失N端结构域的突变体无法发挥类似作用。

Specifically the inactive bent-closed α₅β₁ integrin requires defined glycans for endocytic uptake

通过位点特异性突变和功能分析，研究人员确定了参与Galectin-3识别和寡聚化的关键糖基化位点。位于α亚基头部结构域的N307（对应大鼠N356）和腿部结构域的N867（对应大鼠N918）是Galectin-3寡聚化的核心位点。突变这些位点会显著损害Galectin-3与整合素的共定位和内吞，但不影响整合素的细胞表面表达。有趣的是，其他糖基化位点的突变影响较小，表明不同N-聚糖在功能上存在特异性。

本研究提出的“构象糖基化开关”（conformational glycoswitch）模型为理解膜蛋白功能调控提供了新视角。该发现不仅解释了整合素构象特异性运输的分子机制，还提示类似原理可能适用于其他经历显著构象变化的膜蛋白。Galectin-3寡聚体作为空间N-聚糖模式的“解码器”，在细胞信号转导和膜运输中可能发挥更广泛的作用。

从疾病治疗角度，Galectin-3在纤维化疾病、神经炎症和癌症等病理过程中高表达，本研究揭示的寡聚化机制为开发特异性抑制剂提供了新靶点。同时，该研究强调了对糖基化动态调控的深入理解对揭示细胞表面生物学的重要性，为糖生物学研究开辟了新方向。