RNA海绵CrfA调控新月柄杆菌碳源饥饿适应的分子机制

《Nature Communications》：An RNA sponge directs the transition from feast to famine in Caulobacter crescentus

本研究针对新月柄杆菌如何适应碳源波动这一科学问题，通过Hfq依赖的RNA相互作用组测序(RIL-seq)技术，发现sRNA CrfA作为海绵RNA通过直接碱基配对抑制SisA-D家族sRNA活性，从而在碳饥饿时解除其对TonB依赖性受体等靶基因的抑制。该机制揭示了细菌在营养匮乏环境中转录组重编程的新范式，为理解微生物寡营养生存策略提供了重要理论依据。

　　

在自然界中，细菌生存的环境充满挑战，养分的时空分布极不均匀。作为典型寡营养型水生细菌的新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)，其生存策略的核心在于高效应对碳源"丰沛-匮乏"的剧烈波动。以往研究发现，碳饥饿会诱导大量基因表达重塑，包括十余个TonB依赖性受体(TBDRs)的上调，但其中精细的调控网络尚未明确。

为系统揭示该过程的分子机制，Friedrich Schiller University Jena的研究团队在《Nature Communications》发表论文，通过RNA相互作用连接测序(RIL-seq)技术绘制了新月柄杆菌Hfq依赖的全局RNA互作网络。研究发现，碳饥饿诱导的sRNA CrfA并非直接激活靶基因，而是作为海绵RNA通过Hfq介导的碱基配对抑制SisA-D家族sRNA功能。该机制如同"分子刹车"，在碳源充足时允许SisA抑制代谢相关基因，在饥饿时通过CrfA解除抑制，实现转录组快速重编程。

研究主要采用RIL-seq技术构建Hfq结合的RNA互作网络，通过体内外实验验证RNA相互作用，利用转录组测序(RNA-seq)分析基因表达变化，并采用遗传学手段验证功能。德国研究团队通过构建3xFLAG-Hfq菌株，在稳定期收获样本进行紫外交联和RNA共沉淀，通过邻位连接构建嵌合cDNA文库进行高通量测序。利用报告基因系统验证sRNA与靶基因调控关系，通过点突变和补偿突变实验确认特异性相互作用，并采用Northern blot、Western blot等技术监测分子动态变化。

RIL-Seq分析揭示新月柄杆菌中Hfq依赖的RNA-RNA相互作用组

通过RIL-seq技术，研究人员从3xFLAG-Hfq菌株中获得了484,969个嵌合cDNA，其中60%涉及sRNA。统计分析识别出3,288个独特的RNA-RNA对，包括146个Hfq相关的sRNA相互作用。SisA(CCNA_R0014)作为最活跃的sRNA之一，与多个靶标存在相互作用。通过GFP报告系统验证，10个预测靶标中有8个确实受到SisA的负调控，证实了RIL-seq数据的可靠性。

CrfA与四个同源sRNA SisA、SisB、SisC和SisD直接相互作用

研究发现CrfA与SisA-D家族sRNA存在直接相互作用。这四个sRNA属于αR8 RNA家族，具有保守的10核苷酸单链序列(5'-UUUCCUCCCU-3')，与CrfA第二个G/A富集茎环高度互补。结构探测实验显示，加入任一SisA-D sRNA均能保护CrfA的G49-C63区域，证实了碱基配对。点突变实验进一步证明，破坏CrfA的结合位点会消除其与SisA的相互作用。

Hfq依赖的CrfA与SisA相互作用调控体内sRNA水平

体内实验表明，CrfA过表达可在10分钟内使SisA水平下降5倍，而结合位点突变的CrfA变体则无此效果。补偿突变实验证实，只有当CrfA和SisA的突变相互匹配时，调控关系才能恢复。Hfq缺失显著减弱了CrfA和SisA的相互抑制作用，说明Hfq在促进RNA退火中起关键作用。

通过SisA-CrfA相互作用间接调控靶mRNA

以CCNA_03574(TonB依赖性受体)为代表，研究发现CrfA通过拮抗SisA的负调控作用间接激活靶基因表达。在野生型菌株中，CrfA过表达上调而SisA过表达下调CCNA_03574::gfp报告基因；但在ΔsisA-D菌株中，CrfA失去调控能力。异源表达实验证实SisA通过保守的10-mer序列直接与靶mRNA结合，而CrfA在该系统中不影响报告基因表达。

SisA和CrfA脉冲过表达引起的差异基因调控

转录组分析显示，SisA过表达抑制而CrfA过表达激活47个靶基因，包括多个TBDRs和代谢相关基因。在ΔsisA-D背景下，CrfA失去调控能力，而SisA仍能抑制靶基因，进一步证实CrfA通过拮抗SisA发挥作用。靶基因功能分类显示，SisA主要调控膜转运体和代谢因子，符合碳饥饿适应需求。

碳饥饿期间CrfA依赖的SisA及其靶mRNA调控

碳饥饿实验显示，野生型菌株中CrfA在10分钟内诱导6倍上调，同时SisA下降50倍；而在ΔcrfA或crfA-M2菌株中，SisA水平变化微弱。靶基因mRNA和蛋白水平分析表明，CrfA缺失导致基础表达降低且饥饿诱导减弱，TBDRs蛋白对碳源波动的响应几乎消失。

CrfA缺失对碳饥饿后恢复的负面影响

波动营养实验表明，ΔcrfA菌株在葡萄糖恢复时生长延迟，在木糖恢复时生长几乎完全抑制。这说明CrfA介导的转录组重编程对细菌适应不同碳源至关重要，缺失该机制会严重损害其在自然栖息地中的竞争能力。

研究通过系统解析新月柄杆菌RNA相互作用组，揭示了CrfA作为海绵RNA调控碳饥饿适应的新机制。该工作不仅修正了此前关于CrfA直接激活靶基因的错误认识，更阐明了sRNA网络在细菌环境适应中的核心作用。RNA海绵机制相比蛋白质调控更具能效优势，尤其适合营养匮乏条件。该研究为理解微生物寡营养生存策略提供了新视角，其建立的RIL-seq互作网络数据库(https://caulobacter-interactome.uni-jena.de/)将成为该领域的重要资源。