单细胞mRNA调控网络分析揭示2型糖尿病胰岛细胞特异性致病机制

《Nature Communications》：Single-cell mRNA-regulation analysis reveals cell type-specific mechanisms of type 2 diabetes

本研究针对2型糖尿病(T2D)胰岛细胞异质性机制不清的问题，开发了差异基因协调网络分析(dGCNA)方法，通过对32例人胰岛单细胞测序数据分析，揭示了β细胞中线粒体电子传递链、糖酵解、转录因子网络等11个功能模块的失调特征，并验证了TMEM176A/B调控微丝组织和CEBPG调控未折叠蛋白反应(UPR)的新机制，为理解T2D细胞特异性病理机制提供了新视角。

　　

当胰腺中产生胰岛素的β细胞功能出现障碍，无法分泌足够的胰岛素来调节血糖时，2型糖尿病（T2D）便会发生。然而，胰岛是一个由多种内分泌细胞组成的微型器官，除了β细胞，还有α细胞（分泌胰高血糖素）、δ细胞等。传统研究多将整个胰岛作为整体进行基因表达分析，这可能会掩盖不同细胞类型在疾病中的特异性变化。近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术使得在单个细胞水平上解析基因表达成为可能，但不同研究之间的结果重复性不高，对T2D背景下胰岛细胞功能紊乱的分子机制仍缺乏系统、深入的认识。

为了解决这一问题，并更精确地揭示T2D在特定胰岛细胞类型中的致病机理，研究人员在《Nature Communications》上发表了他们的最新成果。他们开发了一种名为差异基因协调网络分析（differential Gene Coordination Network Analysis, dGCNA）的新计算方法，并将其应用于来自16名T2D患者和16名非糖尿病对照者的人类胰岛高深度单细胞RNA测序数据（Smart-seq2）。该方法不再仅仅关注单个基因表达水平的上调或下调，而是专注于分析在疾病状态下，基因与基因之间的“协调”关系——即它们在同一细胞内的表达关联性——是增强了（超协调）还是减弱了（去协调）。通过构建这种差异化的基因调控网络，研究者能够在无偏见的条件下，系统性地识别出T2D相关的、具有特定生物学功能的基因模块。

主要关键技术方法

本研究整合了两个高质量人胰岛scRNA-seq数据集（共8511个细胞）。核心方法是新开发的dGCNA分析流程，其利用线性混合效应模型计算单细胞类型内基因对的相关性，并通过自助法阈值构建稳健的差异网络（RDN），再进行拓扑分析和基因模块识别。功能验证方面，在INS-1 832/13细胞系中进行了siRNA基因敲低，并利用Tmem176a/b和Cebpg基因敲除小鼠模型以及人胰岛组织进行表型和机制探索，辅以胰岛素分泌测定、钙成像、海马能量代谢分析、蛋白免疫印迹、免疫组化等多种技术。

dGCNA揭示β细胞中T2D相关的功能特异性基因网络

研究人员首先对合并后的数据集进行细胞分群，鉴定出11种不同的细胞类型。随后，他们将dGCNA方法应用于β细胞。分析结果显示出高度的模块性，动态树切割算法识别出11个T2D差异协调基因网络（NDCG）。每个NDCG都对应着高度特异性的基因本体（GO）术语，揭示了T2D β细胞中通路水平的改变。

这11个NDCGs被命名为：“核糖体”、“胰岛素分泌”、“溶酶体”、“未折叠蛋白反应（UPR）”、“微丝”、“糖酵解”、“增殖”、“葡萄糖反应”、“微管”、“线粒体”和“细胞周期”。通过计算每个基因的协调排名得分，发现“核糖体”、“胰岛素分泌”和“溶酶体”这三个网络在T2D中普遍表现为超协调，而其余八个网络（包括UPR、微丝、糖酵解、增殖、葡萄糖反应、微管、线粒体和细胞周期）则表现为去协调。这表明在T2D β细胞中，胰岛素合成、分泌以及溶酶体相关功能可能被增强，而线粒体功能、糖酵解、应激反应、细胞骨架组织、增殖和分化等关键通路则受到干扰。值得注意的是，许多被纳入NDCG的基因其本身的表达水平并未发生显著变化。dGCNA还成功富集到了与T2D风险、空腹血糖相关的GWAS基因，显示了其识别疾病相关通路的有效性。

dGCNA的分析结果稳健且优于差异表达分析

为了验证dGCNA方法的稳健性，研究人员将两个独立的数据集分开进行分析。结果显示，在两个数据集中，T2D β细胞内发生协调性改变的基因有26%是重叠的。更重要的是，比较这些基因所对应的GO术语时，发现了惊人的重叠度。

与传统的差异表达分析（伪批量DESeq2）相比，dGCNA在跨数据集识别T2D相关基因变化方面表现出显著优势。DESeq2分析仅发现极少数显著差异表达的基因，而dGCNA即使在比较相同数量的顶级基因时，其重叠度也远高于DESEq2，证明了其在重现疾病相关发现方面的强大能力。

dGCNA能够预测基因功能并获实验验证

研究团队从五个不同的NDCG中挑选了七个在人类β细胞中功能未知但网络中心性高的基因（TMEM176A/B, DBI, CEBPG, DSTN, GABARAP, SPIRE1, ATRAID）进行功能验证。在INS-1 832/13细胞中敲低这些基因的同源物后，发现均能导致Ins1或Ins2 mRNA表达增加，其中五个基因的敲低还影响了葡萄糖或葡萄糖联合IBMX刺激下的胰岛素分泌。这初步证实了dGCNA预测基因参与T2D相关过程的准确性。

随后，他们对来自“微丝”网络的TMEM176A/B和来自“UPR”网络的CEBPG进行了深入的功能机制研究。

CEBPG是β细胞UPR的关键调控因子

研究发现，CEBPG蛋白在人类β细胞中表达。Cebpg基因敲除（KO）小鼠的β细胞质量和胰岛尺寸减小，且β细胞中UPR调控因子ATF6的核表达降低。

在INS-1 832/13细胞中敲低Cebpg会导致蛋白质聚集增加、分子伴侣GRP78/BiP表达上调，并且消除了毒胡萝卜素（UPR诱导剂）对Atf4, Atf6和Xbp1s的上调作用。这表明CEBPG是UPR正常启动所必需的，其缺失会导致UPR失败和内质网应激加剧。此外，毒胡萝卜素处理能诱导Cebpg表达升高，而敲低Cebpg则逆转了毒胡萝卜素对Ins1和Ins2 mRNA表达的抑制作用。在人类胰岛中敲低CEBPG同样导致INS表达增加，而UPR介质（ATF4, ATF6, XBP1）表达降低。在多种胰岛素促分泌剂（如α-酮异己酸、K⁺、精氨酸、棕榈酸酯）刺激下，Cebpg敲低均能增强胰岛素分泌。这些结果综合证实了dGCNA的预测，即CEBPG是β细胞UPR的重要调控因子，通过影响UPR进而调控胰岛素的生产和分泌。

TMEM176A/B调控β细胞微丝组织

TMEM176B蛋白同样在人类β细胞中表达。在正常饮食下，Tmem176a/b双敲除（DKO）小鼠的β细胞质量和胰岛尺寸减小。在高脂饮食喂养下，DKO小鼠表现出急性胰岛素反应受损和葡萄糖清除能力下降。

与dGCNA将其归类于“微丝”网络的预测一致，Tmem176a/b DKO小鼠的β细胞中肌动蛋白丝密度增加。同样，在INS-1 832/13细胞中敲低Tmem176a/b也导致肌动蛋白丝密度增加和肌动蛋白调控因子Cdc42的表达上调。功能上，Tmem176a/b敲低特异性地增强了IBMX（cAMP增强剂）刺激的胰岛素分泌，而对葡萄糖、α-酮异己酸或K⁺直接刺激的分泌无影响，提示其作用可能依赖于cAMP信号通路，并与放大途径相关。与此相符，敲低细胞中几个关键胞吐蛋白（Snap25, Syt11, Rab27a）和胰岛素转录因子Nkx2.2的表达上调。这验证了TMEM176A/B在调控β细胞微丝组织中的作用，并提示其通过影响细胞骨架和胞吐蛋白表达来调节胰岛素分泌。

在蛋白水平证实dGCNA的发现

对T2D捐赠者胰腺切片的分析进一步在蛋白水平支持了dGCNA的发现。例如，“溶酶体”网络中高排名的KIAA1324（胰岛素敏感受体），在T2D捐赠者的β细胞中蛋白免疫反应性增强。

与“微丝”和“微管”两个细胞骨架相关NDCG的预测一致，T2D捐赠者β细胞中的肌动蛋白丝密度显著增加。同时，与“核糖体”NDCG的超协调性相对应，T2D捐赠者β细胞中的核糖体标志物RPS3的染色密度也更高。这些结果在蛋白层面证实了dGCNA识别出的T2D β细胞关键病理变化。

dGCNA揭示α细胞中非经典的T2D相关网络

研究人员也将dGCNA应用于α细胞，识别出四个T2D相关的NDCGs：“分泌颗粒”（超协调）、“糖酵解”（去协调）、“线粒体”（去协调）和“核糖体”（去协调）。

GO术语分析显示了高度的特异性。与β细胞不同，α细胞中未发现UPR或细胞骨架相关基因网络的改变，但糖酵解、线粒体功能和分泌颗粒相关基因网络的协调性发生了改变，且核糖体相关网络是去协调的。这些发现揭示了T2D中α细胞的特异性改变，与已知的T2D患者α细胞葡萄糖抑制胰高血糖素分泌功能障碍的现象相吻合，并提供了潜在的基因调控基础。dGCNA在α细胞中的分析结果在不同数据集间也显示出良好的可重复性。

研究结论与意义

本研究开发的dGCNA方法，为利用静态单细胞转录组数据推断疾病背景下细胞类型特异性的动态生物学过程提供了一种强大且无偏见的手段。通过对人胰岛细胞的深入分析，研究揭示了T2D在β细胞和α细胞中截然不同的基因调控网络变化，描绘了一幅详细的胰岛细胞分子病变图谱。

在β细胞中，研究发现基础胰岛素生产和胞吐能力在T2D中可能被增强，但刺激-分泌偶联、蛋白质质量控制等关键功能却受到破坏。此外，β细胞还表现出去分化迹象、适应性生长能力下降、与分泌功能受损相容的细胞骨架重构以及溶酶体活性增强。对TMEM176A/B和CEBPG等新型调控因子的功能验证，不仅证实了dGCNA的预测能力，也为理解T2D β细胞功能障碍提供了新的机制见解。在α细胞中，研究揭示了与胰高血糖素分泌失调相关的特异性通路改变，进一步强调了T2D病理机制的细胞特异性。

总之，这项研究极大地深化了对T2D胰岛细胞功能障碍分子基础的理解，所鉴定的众多新基因和通路为未来进一步的功能探索和药物靶点开发提供了丰富的资源。dGCNA分析方法也有望应用于其他复杂组织和疾病的研究中，为揭示疾病机制开辟新的道路。