综述：纳米孔测序在细菌抗菌药物耐药性监测与研究中的应用和优势

《npj Antimicrobials and Resistance》：The applications and advantages of nanopore sequencing in bacterial antimicrobial resistance surveillance and research

本综述系统阐述了纳米孔测序技术在细菌耐药性研究中的革命性影响。文章重点介绍了其长读长、实时测序等技术优势，及其在构建完整细菌基因组、快速检测抗菌药物耐药基因（ARGs）以及解析多重耐药（MDR）区域动态演化方面的独特应用。作者强调，该技术为理解耐药基因的传播机制和开发有效控制策略提供了强大工具，是应对全球抗菌药物耐药性（AMR）威胁的重要进展。

　　

纳米孔测序技术的发展与优势

纳米孔测序的原理是基于DNA单链通过蛋白质纳米孔时引起的电流变化来解读序列。该技术自概念提出至今，历经数十年发展，已克服了诸如DNA分子穿膜、碱基识别及速率控制等关键难题。2014年，牛津纳米孔技术公司（ONT）推出了首个商用纳米孔测序仪MinION，标志着该技术进入快速发展阶段。此后，中国公司如齐碳科技和华大智造也相继推出了自主开发的纳米孔测序平台，如QNome-9606和CycloneSEQ，进一步推动了该技术的普及和应用。

纳米孔测序的优势体现在多个方面。与Illumina等短读长测序平台相比，其超长读长（N50 > 100 kb）能够跨越整个多重耐药区域和复杂的遗传结构，从而实现对细菌基因组更全面的分析。相较于PacBio等其他长读长平台，纳米孔测序设备更便携、成本更低，且能进行实时测序，在临床现场和资源有限环境中展现出巨大潜力。随着测序化学（如ONT Q20+）的进步，其原始读长准确率已超过99%，使得仅凭纳米孔数据即可构建高精度的完整细菌基因组。

快速鉴定细菌抗菌药物耐药性

多重耐药细菌的快速基因组解析

传统短读长测序难以准确解析MDR细菌基因组中常见的复杂区域，如耐药岛、基因组重排和大片段重复元件。纳米孔长读长测序通过生成能够跨越这些区域的长读长，有效克服了短读长的局限性。早期通常采用纳米孔长读长与短读长相结合的混合组装策略来提升基因组准确性。随着ONT R10.4等高精度测序化学的出现，仅使用纳米孔数据即可在约14小时内获得准确性超过99.9%的完整细菌基因组，大大缩短了周转时间。

通过纳米孔长读长宏基因组学鉴定和定量耐药基因

环境中的ARGs传播已成为重要的环境污染物。传统的qPCR方法耗时且只能靶向已知基因。短读长宏基因组学虽能提供更全面的视角，但难以有效解析ARGs的遗传结构和宿主信息。纳米孔长读长宏基因组学则能生成更长的读长（N50通常为3-8 kb），实现更完整的基因组组装，并能直接观察ARGs与移动遗传元件（如质粒、转座子）的关系，从而更准确地追踪其宿主信息和传播动态。例如，在污水处理厂等复杂生态系统中，纳米孔测序成功揭示了ARGs通过移动遗传元件在不同处理阶段间的传播动态。

通过纳米孔长读长靶向测序快速鉴定耐药基因

在低生物量样本（如下呼吸道感染样本）中检测低丰度ARGs对有效治疗至关重要。纳米孔测序结合CRISPR/Cas9靶向富集或自适应采样（adaptive sampling）等创新技术，显著提高了检测灵敏度。Cas9靶向富集可特异性富集并测序目标ARGs，甚至在10分钟实时测序内即可完成鉴定，将总周转时间缩短至6小时以内。自适应采样则通过选择性去除宿主DNA，富集微生物DNA，从而在ARGs丰度较低的情况下也能实现灵敏检测，周转时间可控制在4小时内，临床分类符合率超过90%。

ARGs和MDR区域的结构多样性与动态分析

关键耐药基因的遗传结构特征解析

移动性碳青霉烯酶基因bla_NDM、粘菌素耐药基因mcr和替加环素耐药基因tet(X)的出现对公共卫生构成严重威胁。这些基因通常位于质粒或其他移动遗传元件上。纳米孔长读长测序已成功解析了多种携带这些基因的质粒（如bla_NDM位于IncX3、IncC型质粒；mcr位于IncX4、IncI2型质粒；tet(X)位于IncF杂交质粒）以及更复杂的遗传结构，如染色体整合质粒、大转座子和整合接合元件（ICE）。此外，纳米孔测序还揭示了超级细菌（如同时携带mcr-1、tet(X4)和bla_NDM-5的大肠杆菌）中不同关键ARGs共存的精确基因组位置，为了解其水平传播模式提供了关键见解。

携带ARGs遗传结构的串联扩增

细菌异质性耐药通常由ARGs在细菌基因组内的串联扩增引起。纳米孔超长读长测序能够解析复杂的串联重复结构，这些结构通常由包含移动遗传元件和一个或多个ARGs的可转移单元（TU）多次重复构成。例如，在肠杆菌科细菌的质粒中，aphA1基因的串联扩增导致妥布霉素耐药，IS26介导的bla_TEM-1B扩增导致哌拉西林/他唑巴坦耐药。通过优化DNA提取方法获得超长片段，纳米孔测序甚至可以解析跨度数十kb的复杂串联重复区域，如tmexCD1-toprJ1基因簇，并直接证实插入序列在串联重复区形成中的作用。类似现象在革兰氏阳性菌（如粪肠球菌中的poxtA串联重复）中也有发现。

MDR移动遗传元件的结构特征与动态演化

MDR区域和融合质粒的形成是一个复杂动态过程。大型移动元件，如沙门菌基因组岛（SGI）和ICE，通常包含多个ARGs，并因频繁重组而呈现高度复杂的结构。纳米孔测序极大地改善了对这些结构的解析能力，近年来促进了多种SGI、PGI和ICE的鉴定。融合和重组质粒在细菌分裂或接合转移过程中会发生结构变化。纳米孔长读长测序不仅能解析其详细结构，还能观察质粒在接合转移过程中的动态变化，例如携带碳青霉烯酶基因的质粒与携带毒力基因的质粒发生融合，导致碳青霉烯耐药兼高毒力肺炎克雷伯菌的出现。这些动态变化加速了ARGs的聚集和共转移。

纳米孔测序在AMR研究中的新兴应用

目前，纳米孔测序在细菌耐药性研究中的应用主要集中于DNA测序。然而，其直接RNA测序和DNA甲基化修饰检测等功能在AMR研究中的应用尚处起步阶段。直接RNA测序无需cDNA合成，可更准确地分析细菌在抗菌药物压力下的基因表达，为了解ARGs的调控机制提供新视角。直接检测DNA甲基化修饰则有助于理解表观遗传变化在耐药性产生中的作用。

结论与展望

解读MDR细菌的遗传结构对于理解抗菌药物耐药性的进化和传播至关重要。纳米孔长读长测序技术以其实时测序和超长读长两大独特优势，正在革新细菌耐药性研究。其快速周转能力实现了对细菌耐药的快速诊断和实时监测；其超长读长能力则使得详细表征复杂遗传区域和追踪MDR遗传结构的动态演化成为可能。尽管当前测序错误率和单样本成本在一定程度上限制了其更广泛的应用，但随着技术的持续发展和多公司商业化竞争的推进，预计纳米孔测序将在应对日益严峻的全球AMR威胁中发挥越来越重要的作用。