伊比利亚北部獾体内Trypanosoma pestanai的分子流行调查及风险因素分析

《Parasitology》：Molecular Survey and Risk Factors of Trypanosoma pestanai in Eurasian Badgers from the Northern Iberian Peninsula

本研究针对伊比利亚半岛獾群中Trypanosoma pestanai的感染情况未知的问题，通过分子检测方法首次证实该寄生虫在西班牙北部獾群中的存在。研究人员采用SYBR Green和TaqMan两种实时荧光定量PCR技术，对145份獾脾脏样本进行检测，发现总感染率为35.2%，且欧西伯利亚生物区的感染风险显著高于地中海生物区。该研究填补了地域空白，为理解该寄生虫的生态分布及传播动力学提供了重要依据。

　　

在野生动物健康研究领域，欧亚獾（Meles meles）作为一种广泛分布于古北区的鼬科哺乳动物，不仅是生态系统中的重要组成部分，还可能作为多种病原体的储存宿主。其中，一种名为Trypanosoma (Megatrypanum) pestanai的细胞外血液寄生虫，以獾作为其天然宿主，已在英国、法国、意大利等多个欧洲国家的獾群中被发现。然而，位于欧亚獾分布区西南边缘的伊比利亚半岛，其獾群中是否存在这种寄生虫的感染，此前完全是一个未知数。这种知识上的空白限制了对该寄生虫地理分布范围、生态学及其潜在公共卫生意义的全面理解。为了解决这一问题，一个由西班牙和多国研究人员组成的团队开展了一项针对性的研究，其成果最终发表在寄生虫学专业期刊《Parasitology》上。

为了回答伊比利亚半岛獾群中是否存在T. pestanai感染以及哪些因素可能影响其感染风险这两个核心问题，研究人员进行了一项分子流行病学调查。他们巧妙地利用了机会性采样策略，收集了在西班牙北部四个自治区（阿拉贡、纳瓦拉、巴斯克地区、加泰罗尼亚）因道路交通事故死亡的獾的样本，共计145只。这些样本在送往各地的野生动物康复中心或区域实验室后，进行了系统的尸检，记录了每只动物的性别、年龄以及发现地的GPS坐标，并采集了脾脏样本用于后续的分子生物学分析。

本研究主要依赖于分子检测技术。核心方法是开发了两种高灵敏度的实时荧光定量PCR（qPCR） assay（检测方法），均靶向T. pestanai的18S rRNA基因片段。第一种是基于SYBR Green染料的qPCR，第二种则使用了特异性更高的TaqMan探针技术。研究人员首先使用克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）的DNA来优化SYBR Green方法的反应条件，并通过后续的测序验证了其特异性。随后，他们设计了针对T. pestanai的特异性引物和探针，并选择了一个经测序确认的阳性样本作为TaqMan方法的阳性对照。这种严谨的方法学开发确保了检测结果的可靠性。此外，为了进一步确认寄生虫的种类，研究人员还对一部分qPCR阳性样本进行了常规PCR扩增，靶向约900 bp的18S rRNA基因片段，并对扩增产物进行了Sanger测序和系统发育分析，从而在基因水平上对病原体进行了确证。在数据分析方面，研究计算了两种qPCR方法的一致性（Kappa系数），并采用二元逻辑回归模型来评估生物地理区域（欧西伯利亚区 vs. 地中海区）、宿主性别和年龄等变量与T. pestanai感染状态之间的统计学关联。

研究结果

T. pestanai的流行率与检测方法比较

分子检测结果显示，在西班牙北部的獾群中，T. pestanai的感染是普遍存在的。使用SYBR Green qPCR检测的流行率为23.6%，而使用TaqMan qPCR检测的流行率更高，为31%。两种检测方法表现出极好的一致性（Kappa = 0.805）。当将至少一种方法检测为阳性的样本定义为阳性时，计算出的总体感染率为35.2%（95%置信区间为27.4% - 42.9%）。这一结果与欧洲其他一些地区（如法国）报告的流行率相近，但低于罗马尼亚等国的报告。TaqMan方法检测出的流行率更高，可能源于其检测下限更低，能够识别出寄生虫载量较低的感染。

感染风险因素分析

逻辑回归分析揭示了一个关键发现：生物地理区域是影响T. pestanai感染风险的显著因素。生活在欧西伯利亚生物区的獾，其感染率（41.9%）显著高于生活在地中海生物区的獾（18.9%）。根据优势比（Odds Ratio）计算，欧西伯利亚区獾的感染风险是地中海区獾的3.04倍。相比之下，宿主的性别和年龄与感染状态之间没有发现统计学上的显著关联。这一结果与某些先前研究一致，但与另一些研究发现幼獾感染率更高的报道不同。

分子确认与系统发育分析

为了确证qPCR阳性结果的特异性，研究人员对11个阳性样本进行了常规PCR和测序分析，最终获得了9条高质量序列。这些序列与GenBank中已知的T. pestanai序列显示出极高的相似度（99.75% - 100%）。系统发育分析将这些新获得的序列明确地归入T. pestanai的进化枝中，与来自法国、奥地利等地的獾源T. pestanai序列紧密聚类。这从分子水平上确凿地证明了在伊比利亚半岛獾中检测到的寄生虫就是T. pestanai，排除了其他种类锥虫的可能性。

本研究首次证实了锥虫Trypanosoma pestanai在伊比利亚半岛獾群中的存在，填补了该寄生虫地理分布图谱上的一个重要空白。研究结果表明，T. pestanai是当地獾群中一种常见的寄生虫，总体感染率约为35%，这一发现与欧洲其他地区的流行情况具有可比性。研究的核心结论是，气候和生态环境是影响该寄生虫传播的关键因素。欧西伯利亚区（气候更凉爽湿润）的感染风险显著高于地中海区（气候更温暖干燥），这强烈提示更湿润的环境条件可能有利于寄生虫的存续和传播。这种影响可能通过多种途径实现，例如促进其主要疑似媒介——獾蚤（Paraceras melis）的繁殖和生存，或者影响獾的社群行为（如欧西伯利亚区的獾可能形成更大、更稳定的社群和洞穴系统，有利于媒介和寄生虫在宿主间的传播）。

在方法论上，研究成功开发并验证了SYBR Green和TaqMan两种qPCR检测方案，为未来针对T. pestanai的流行病学监测和研究提供了可靠工具。研究人员还提出了一个经济高效的检测策略：先使用成本较低的SYBR Green法进行大规模初筛，再对临界值样本或结果不明确的样本用特异性更高的TaqMan法进行确认。

尽管T. pestanai目前不被认为是一种人兽共患病病原体，但研究也指出它已在家犬和欧洲野兔等物种中被检测到，表明其具备跨越物种屏障的潜力。因此，这项研究的意义不仅在于记录了一种寄生虫在新地域的存在，更在于为理解其生态学、传播动力学以及潜在宿主范围奠定了基础。未来的研究需要进一步探索T. pestanai在伊比利亚半岛其他野生动物乃至家养动物中的感染情况，明确其确切的传播媒介，并更深入地阐明环境因素如何调控其传播循环。将这些发现告知兽医专业人士，也有助于提高对该寄生虫的认识，并在相关临床病例的鉴别诊断中加以考虑。总之，这项研究增进了我们对野生动物寄生虫病的认识，凸显了在“同一健康”（One Health）框架下开展野生动物健康监测的重要性。