综述：哺乳动物细胞转基因整合：工具、挑战与未来

《Cell Systems》：Transgene integration in mammalian cells: The tools, the challenges, and the future

这篇综述系统梳理了哺乳动物细胞转基因整合的技术进展与应用挑战。文章重点比较了随机整合（病毒载体、转座子系统）与位点特异性整合（核酸酶介导的HDR、Prime Editing、位点特异性重组酶SSRs）两大策略，详细分析了各种方法的整合效率、载荷容量、细胞适用性等关键参数。作者特别强调了新兴技术（如PASSIGE、桥RNA系统）在克服传统瓶颈（如低效率、脱靶效应、基因沉默）方面的潜力，并指出未来发展方向在于开发高效、安全的整合工具以推动细胞治疗（如CAR-T）和生物制造等领域的应用。

　　

随机基因组整合

实现稳定转基因表达的首要挑战是将外源基因成功整合至宿主基因组。早期研究发现的"自发稳定转染"现象，揭示了哺乳动物细胞通过非同源重组（NHR）机制随机整合DNA的能力，但效率极低（0.1%-0.4%）。为提升效率，病毒载体和转座子系统成为主流随机整合工具。

病毒载体系统（如γ-逆转录病毒和慢病毒）利用病毒天然感染机制，将转基因递送至细胞核。慢病毒因其可感染非分裂细胞（如原代细胞）的优势，在CAR-T细胞治疗、基因组CRISPR筛选等领域应用广泛。然而，病毒载体存在包装容量限制（慢病毒约8 kb，AAV仅约4 kb），且整合位点偏好转录活跃区域，可能导致表达异质性或插入突变风险。

转座子系统（如Sleeping Beauty和piggyBac）通过"剪切-粘贴"机制实现非病毒依赖的整合。其优势在于操作简便、避免病毒组件引起的免疫反应，且可承载更大载荷（最高达190 kb）。但整合仍近乎随机，难以控制拷贝数，且持续活性的转座酶可能导致基因组"足迹"积累。近年来，通过融合CRISPR-Cas系统（如CASTs）或直接演化转座酶（如进化型Bxb1），研究者正尝试赋予转座子系统位点特异性整合能力。

精确基因组编辑

为克服随机整合的缺陷，位点特异性整合技术应运而生。核酸酶介导的整合利用CRISPR-Cas9等工具在特定基因组位点引入双链断裂（DSBs），并通过细胞自身的同源定向修复（HDR）途径将 donor 模板精准插入。尽管策略多样（如HITI、PE），但HDR效率普遍较低（尤其在非分裂细胞中），且DSB可能引发错误修复（如NHEJ）导致脱靶突变。

Prime Editing（PE）系统通过Cas9切口酶与逆转录酶融合，实现了无需DSB的精准编辑。其pegRNA可引导短序列（最长250 bp）插入，且脱靶效应显著低于传统CRISPR-Cas9。然而，PE目前仍受限于编辑长度，难以承载大片段转基因。

位点特异性重组酶（SSRs）

SSRs（如Cre、Flp、Bxb1）通过识别特定位点（如loxP、FRT、attP/B）实现可预测的整合。该技术核心是预先在基因组中构建"着陆垫"（Landing Pad, LP），包含重组酶识别序列及筛选标记。后续整合只需将携带对应位点的转基因与重组酶共转染，即可高效完成单拷贝定点插入。

LP设计策略多样：例如，双位点LP可实现基因盒交换而非全质粒整合；引入正负双向筛选标记（如TK/ganciclovir系统）可高效富集正确整合细胞。SSRs的优势在于整合效率高（可达60%）、拷贝数可控，且支持多重正交整合（通过交替使用不同重组酶/识别位点）。但其应用依赖预构建的LP细胞系，且天然基因组中可能存在类似识别序列，引发脱靶整合。

挑战与展望

当前技术仍面临四大核心挑战：整合效率（尤其在原代细胞中）、阳性群体筛选（需优化标记设计以避免假阳性）、整合位点选择（"安全港"基因座如AAVS1、ROSA26的沉默问题尚未完全解决），以及大片段载荷（>100 kb）的递送效率。新兴技术如PASSIGE（结合PE与SSRs）和桥RNA系统（如IS110重组酶）展示了"一步法"精准整合的潜力，有望突破现有瓶颈。未来，通过理性设计整合工具与细胞调控网络的互作，将推动哺乳动物细胞在基因电路构建、染色体尺度工程等复杂应用中的发展。