植物长链非编码RNA体内二级结构调控翻译与稳定性的进化保守性研究

《Plant Communications》：In vivo RNA structure influences the translation and stability of plant long noncoding RNAs

本研究针对植物长链非编码RNA（lncRNA）的转录后调控机制尚不明确的科学问题，通过比较拟南芥（Arabidopsis thaliana）和硬粒小麦（Triticum turgidum ssp. durum）两种代表性植物模型，系统揭示了lncRNA体内RNA二级结构对其翻译效率（TE）和RNA稳定性的核心调控作用。研究人员利用体内RNA结构图谱（SHAPE）、核糖体图谱和转录组衰变分析等技术，发现尽管lncRNA序列在植物界保守性有限，但在进化支内呈现中度保守，并形成稳定的保守RNA结构基序（RSM）。研究首次绘制了植物lncRNA的翻译和稳定性全景图，鉴定出分别调控翻译和稳定性的结构基序（如hRSMs、lRSMs、sRSMs、uRSMs），且这些基序显著富集于lncRNA的3'端。该研究发表于《Plant Communications》，为理解RNA结构介导的植物lncRNA功能调控提供了全新视角，对揭示非编码RNA的进化与调控机制具有重要意义。

　　

在植物基因组中，长链非编码RNA（long non-coding RNAs, lncRNAs）作为长度超过200个核苷酸的非编码转录本，已成为调控发育过程和应激反应的关键分子。然而，与哺乳动物中lncRNAs的广泛研究相比，植物lncRNAs的研究仍处于起步阶段。以往研究多聚焦于lncRNAs的序列分析及其在转录水平的调控功能，而对其他关键特征，尤其是其在活细胞内的RNA二级结构以及转录后调控活动（如翻译和RNA稳定性）的理解仍十分有限。这种认知缺口在很大程度上限制了我们对植物lncRNAs生物学功能的全面认识。值得注意的是，此前对信使RNA（mRNA）的研究表明，RNA二级结构在调控翻译和RNA稳定性中扮演着 pivotal 角色，那么，一个核心科学问题随之产生：RNA二级结构是否同样是调控植物lncRNAs命运的关键因素？为了回答这一问题，研究人员选择在植物研究领域具有代表性的两种模式植物——双子叶植物模型拟南芥（Arabidopsis thaliana）和单子叶植物模型硬粒小麦（Triticum turgidum ssp. durum ‘Kronos’），开展了一项跨物种的比较研究，旨在系统揭示植物lncRNAs的关键特征及其转录后调控规律。相关成果发表在植物科学领域权威期刊《Plant Communications》上。

为了系统解析植物lncRNAs的特性，研究人员首先对拟南芥和小麦中的lncRNAs进行了鉴定和分类。他们依据lncRNAs与邻近蛋白编码基因的空间位置关系，将其划分为八种类型。分析发现，Same-strand类型的lncRNAs在两种物种中均占主导地位。进一步的特征比较揭示，拟南芥的lncRNAs平均长度（523.95 bp）显著短于小麦（855.49 bp），而小麦lncRNAs的GC含量（48.36%）则高于拟南芥（38.92%）。尤为重要的是，研究人员利用先前已发表的体内RNA结构图谱数据（SHAPE-Structure-seq），获取了千余条lncRNAs在核苷酸分辨率上的结构信息。分析显示，小麦lncRNAs具有更低的平均SHAPE反应性值，表明其倾向于形成更稳定、更复杂的体内RNA二级结构，这与它们较高的GC含量相一致。

在进化保守性方面，研究发现植物lncRNAs在整个植物界范围内序列保守性很低，但在各自的进化支内部（如拟南芥所属的十字花科Brassicaceae和小麦所属的禾本科Poaceae）却表现出中度保守性（平均保守性均超过50%）。更为有趣的是，研究人员利用CMfinder算法，在拟南芥33%和小麦60%的lncRNAs中鉴定出了保守的RNA二级结构基序。通过计算阳性预测值（PPV），他们发现这些预测的保守结构与基于SHAPE实验数据约束的体内RNA折叠结构高度一致（拟南芥PPV平均0.936，小麦0.984）。此外，对这些保守基序区域的香农熵（Shannon Entropy）分析表明，其值显著低于lncRNAs的其他区域，提示这些保守的RNA结构基序在体内倾向于形成稳定且确定的二级结构。

研究团队随后深入探索了lncRNAs的转录后调控景观。通过分析 polysome profiling（核糖体图谱）和RNA-seq数据，他们发现拟南芥和小麦中分别有28%和45%的lncRNAs与多核糖体结合，表明相当一部分lncRNAs正在进行活跃的翻译。lncRNAs的翻译效率（Translation Efficiency, TE）在两种物种中均呈现广泛的变异。通过相关性分析，研究人员评估了可能影响lncRNA翻译的因素，包括转录本长度、GC含量和体内RNA结构。结果表明，在两种植物中，lncRNAs的翻译效率均与反映RNA单链特性的SHAPE反应性值呈显著正相关，而与反映碱基配对概率（Base Pairing Probability, BPP）的值呈显著负相关。这意味着体内RNA二级结构越弱（单链区越多）的lncRNAs，其翻译效率往往越高；反之，结构越稳定的lncRNAs越不利于翻译。这一发现凸显了体内RNA二级结构是调控植物lncRNA翻译效率的一个主要因素。

在RNA稳定性方面，研究人员利用转录抑制剂虫草素（cordycepin）处理并追踪lncRNAs的丰度变化，从而计算出它们的衰变速率和半衰期。结果显示，植物lncRNAs的稳定性存在巨大差异，半衰期从短短1.98分钟到超过24小时不等。平均而言，拟南芥lncRNAs的半衰期（136.4分钟）短于其mRNAs，而小麦lncRNAs的半衰期（10.54小时）则长于其mRNAs，表明lncRNAs的稳定性在双子叶和单子叶植物间可能存在较大分歧。相关性分析再次确认了RNA结构的关键作用：在拟南芥和小麦中，lncRNAs的稳定性均与SHAPE反应性呈负相关，与BPP呈正相关，说明具有更强、更稳定二级结构的lncRNAs往往也更稳定，降解速率更慢。

为了更精确地识别出直接参与调控翻译和稳定性的RNA结构单元，研究人员运用了pyTEISER计算生物学工具，在全转录组范围内系统性地搜寻与高翻译效率（high-TE）或低翻译效率（low-TE）相关的RNA结构基序（RSMs），以及与高稳定性（stable）或低稳定性（unstable）相关的RSMs。在拟南芥和小麦的lncRNAs中，他们分别鉴定出了数百个具有统计学意义的翻译相关和稳定性相关的RSMs。值得注意的是，与抑制翻译相关的lRSMs数量远多于促进翻译的hRSMs，而与增强稳定性相关的sRSMs数量也多于导致不稳定的uRSMs。对这些基序在lncRNAs转录本上位置分布的分析揭示了一个非常有趣的现象：无论是翻译相关还是稳定性相关的RSMs，都显著富集于lncRNAs的3'端区域。这与在mRNAs中观察到的模式（翻译相关结构多位于5'UTR，稳定性相关结构多位于3'UTR）形成了对比，暗示lncRNAs可能采用了独特的、依赖于3'端结构的调控机制。

本研究主要整合运用了以下几种关键技术方法：首先，利用公共数据库和同源比对鉴定拟南芥和小麦的lncRNAs并进行分类。其次，采用体内RNA结构图谱技术（SHAPE-Structure-seq）获取核苷酸分辨率的RNA二级结构信息。第三，通过核糖体图谱（Polysome Profiling）和RNA测序（RNA-seq）分析lncRNAs的翻译活性与效率。第四，应用转录抑制剂（虫草素）处理结合时间序列转录组测序来估算lncRNAs的衰变速率和半衰期。第五，利用CMfinder和pyTEISER等生物信息学工具进行保守RNA结构基序的识别以及与表型（翻译效率、稳定性）关联的功能性结构基序挖掘。研究所用的小麦材料为硬粒小麦品种‘Kronos’，拟南芥为常用模型生态型。

研究结果

植物lncRNAs在拟南芥和小麦中的特征刻画

研究人员系统比较了拟南芥和小麦lncRNAs的序列长度、GC含量、体内RNA二级结构和序列保守性。发现小麦lncRNAs普遍更长、GC含量更高，且体内RNA结构更稳定。尽管跨植物界保守性低，但在各自进化支内（十字花科/禾本科）呈现中度序列保守。

拟南芥和小麦lncRNAs中RNA二级结构保守性的表征

研究发现相当比例的lncRNAs含有保守的RNA二级结构基序，这些基序与实验测得的体内RNA结构高度吻合，并且其所在区域香农熵较低，表明它们在体内形成稳定结构。

植物lncRNAs的转录后调控景观

研究揭示了植物lncRNAs存在广泛的翻译效率和RNA稳定性变异。相关性分析表明，体内RNA二级结构是影响两者最关键的因素：结构越松散越利于翻译，但越稳定则越利于RNA存留。

系统性发现调控拟南芥和小麦lncRNA翻译效率的RNA结构基序

通过计算生物学方法，鉴定出大量与高/低翻译效率相关的RNA结构基序（hRSMs/lRSMs），其中抑制翻译的基序（lRSMs）占多数。这些基序显著富集于lncRNAs的3'端。

系统性发现调控拟南芥和小麦lncRNA稳定性的RNA结构基序

同样鉴定出大量与高/低稳定性相关的RNA结构基序（sRSMs/uRSMs），其中增强稳定性的基序（sRSMs）占多数。这些稳定性相关基序也同样富集于lncRNAs的3'端。

结论与讨论

本研究通过对拟南芥和小麦两种代表性植物的比较分析，全面描绘了植物长链非编码RNA（lncRNA）的关键特征及其转录后调控全景图。研究发现，植物lncRNAs在转录本长度、GC含量、体内RNA结构以及序列保守性方面均表现出显著的物种特异性，提示lncRNAs可能比mRNAs经历更快速的进化演变。尤为重要的是，尽管lncRNAs在整体植物界范围内序列保守性有限，但在特定的进化支内部却保持了中度的序列保守性，并且这种保守性与稳定的体内RNA二级结构基序的形成相关联。

研究的核心发现在于确立了体内RNA二级结构是调控植物lncRNA翻译效率和RNA稳定性的主导因素。研究人员不仅观察到了RNA结构与这些转录后过程之间的强相关性，更进一步通过全转录组范围的系统性筛选，鉴定出了数百个具体的、具有统计学意义的RNA结构基序（RSMs），这些基序分别与lncRNAs的高/低翻译效率（hRSMs/lRSMs）和高/低稳定性（sRSMs/uRSMs）相关。一个非常值得关注的模式是，无论是翻译相关还是稳定性相关的RSMs，都显著倾向于分布在lncRNAs转录本的3'末端区域。这与蛋白质编码mRNA中常见的调控模式（翻译调控多在5'UTR，稳定性调控多在3'UTR）有所不同，可能揭示了lncRNAs特有的、依赖于3'端结构的转录后调控机制。

该研究的意义重大，它首次在植物中大规模地揭示了RNA结构在lncRNA功能调控中的核心地位，将植物非编码RNA研究从传统的序列和转录水平拓展到了结构生物学和转录后调控的新维度。所鉴定出的特异性RNA结构基序为未来深入研究关键lncRNAs的功能机制提供了宝贵的候选靶点。这些发现为理解lncRNAs在植物发育、逆境响应等生命过程中的作用奠定了坚实的基础，并开辟了通过操纵RNA结构来调控基因表达的新可能途径。总之，这项工作为植物RNA生物学领域提供了丰富的资源和全新的视角，必将推动对植物非编码RNA世界更深入的探索。