利用sortase技术将耐热且可回收的南极假丝酵母（Candida antarctica）脂肪酶B固定在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）上

《Microbiology Spectrum》：Thermostable and recyclable Candida antarctica lipase B immobilized on Bacillus subtilis using sortase technology

通过sortase介导系统将Candida antarctica脂酶B（CALB）固定于Bacillus subtilis细胞表面，开发了一种新型整细胞生物催化剂。实验表明，该固定化CALB在37°C和pH 8.0条件下表现出优异的热稳定性和pH稳定性，重复使用9次后活性仍保持50%，长期存储（8周）活性损失较小。该催化剂在鱼油水解中高效释放Omega-3脂肪酸（EPA/DHA），具有应用于食品加工、制药和生物柴油生产的潜力，且方法环保、可扩展。

　　本研究介绍了一种利用细菌表面展示技术将**Candida antarctica**脂肪酶B（CALB）固定在**Bacillus subtilis**细胞表面的新方法。这种技术通过**sortase**介导的系统实现，能够将经过基因工程改造的CALB变体稳定地锚定在细菌表面，无需额外的纯化或化学修饰。研究结果显示，这种表面展示的CALB在37°C和pH 8.0条件下表现出最优的催化活性，并且在9次重复使用后仍能保留约50%的活性，储存8周后仍保持超过50%的初始活性。此外，这种表面展示的CALB在鱼油水解过程中能高效地选择性释放ω-3多不饱和脂肪酸（EPA和DHA），显示出其在食品、制药和营养补充剂工业中的应用潜力。该研究建立了一种可扩展且环保的酶固定方法，通过**B. subtilis**作为宿主，sortase介导的固定方法为开发热稳定、可重复使用且工业适用的全细胞生物催化剂提供了坚实的基础。

### 研究背景与意义

在生物技术领域，酶的稳定性、可重复使用性和可持续性是工业应用中的关键挑战。传统方法中，酶通常以游离形式存在，其在恶劣反应条件下的稳定性较差，回收和再利用的难度也较大，同时高昂的使用成本限制了其在工业中的广泛应用。为此，酶固定技术被广泛研究，以增强其在工业过程中的实用性。酶固定不仅可以提高其热稳定性和操作稳定性，还能实现其重复使用，从而降低成本并减少环境影响。

固定酶在非生物表面（如硅聚合物、银纳米颗粒和磁性纳米颗粒）已被证明具有一定的潜力，但这些方法通常较为复杂、昂贵，并且对环境可能产生不利影响。相比之下，固定在活微生物表面（如**Saccharomyces cerevisiae**、**Pichia pastoris**、**Bacillus subtilis**孢子、**Pseudomonas putida**和**Escherichia coli**）提供了一种更可持续的选择。活细胞不仅作为载体，还作为催化剂，提供生物相容性、易于规模化生产以及增强酶的保护作用。

在多种微生物展示系统中，**Bacillus subtilis**因其坚固的细胞壁和能够将蛋白质展示在其表面的能力而脱颖而出。其中，**sortase**介导的固定技术是一种特别有前景的方法，它利用sortase酶将蛋白质共价连接到细菌细胞壁上。该方法通过在蛋白质的C端加入细胞壁结合基序（CWM），包括识别基序（如**B. subtilis**中的LPDTS基序）、疏水区域和带电尾部，实现蛋白质的特异性锚定。**YhcS**是**B. subtilis**中的一种sortase酶，它能够切割识别基序并将其共价连接到细胞壁的肽聚糖层上，从而确保酶的稳定固定。

尽管酶固定技术在生物催化领域取得了显著进展，但许多现有技术在简化性、可扩展性和成本效益方面仍有不足。本研究通过sortase介导的固定技术，成功开发出一种新型全细胞生物催化剂，解决了这些问题。具体而言，我们将CALB基因与**B. subtilis**的sortase基因（YhcS）共表达，利用**WASD**（ΔwprA ΔsigD）菌株作为宿主，实现了CALB在细菌表面的高效固定。这种技术不仅提高了酶的稳定性，还简化了生产流程，避免了额外的纯化或化学交联步骤，使该方法更加适合工业应用。

### 材料与方法

本研究中使用的细菌菌株和质粒如**Table 1**所示。**E. coli DH5α**和**Bacillus subtilis WASD**分别用于基因克隆和酶表面展示实验。**E. coli**细胞在含有50 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中培养，而**B. subtilis**细胞则在富含营养的SRM培养基中生长，pH为7.5，补充25 μg/mL四环素，并在30°C下培养14小时以进行后续分析。

在构建质粒方面，我们使用了包含**XhoI**和**BamHI**限制性位点的引物LIPF1和LIPR1，通过PCR扩增CALB基因。随后，将扩增的CALB片段连接到pSpA-YhcS质粒中，该质粒原本用于在**B. subtilis**表面展示蛋白A。通过这种设计，我们得到了新的重组质粒pCALB-YhcS，其中包含了CALB的编码区域、细胞壁结合基序（CWM）以及sortase酶YhcS。通过这种方法，我们实现了CALB在**B. subtilis**表面的共价固定。

在实验过程中，我们通过热休克法将重组质粒导入**E. coli DH5α**细胞中，并在含有四环素的LB培养基中筛选阳性克隆。确认质粒序列后，我们将pCALB-YhcS导入**B. subtilis WASD**菌株中，并使用自然转化方法进行表达。表达过程包括在37°C下培养16小时，随后在SRM培养基中继续培养6小时，并加入四环素以增强表达。

为了验证CALB是否成功固定在**B. subtilis**表面，我们使用SDS-PAGE分析了细胞壁和原生质体的蛋白组分。通过添加溶菌酶并进行离心处理，我们能够将固定在细胞壁上的蛋白与细胞内蛋白区分开。实验结果显示，**B. subtilis**细胞壁中存在一个约33 kDa的蛋白条带，与CALB的分子量一致，而对照组中未检测到该条带，确认了CALB的成功固定。

为了评估酶的活性，我们使用**p-nitrophenyl butyrate**（p-NPB）作为底物，通过紫外分光光度计监测**p-nitrophenol**的释放情况。我们还进行了热稳定性测试，评估在37°C、40°C、45°C和50°C条件下，酶活性在8小时内的保留情况。通过计算T??（即8小时后保留50%活性的温度），我们发现**B. subtilis**表面展示的CALB（Bs-CALB）在40.2°C时仍能保留50%的活性，而游离的CALB在36.5°C时仅能保留10.2%的活性。这表明表面固定显著提高了酶的热稳定性。

此外，我们还评估了Bs-CALB在不同pH条件下的稳定性，范围从4.5到9.5。结果显示，Bs-CALB在pH 8.0时达到最高活性，并在不同pH条件下保持较高的稳定性。相比之下，游离的CALB在非最佳pH条件下活性下降更为明显。这种稳定性对于工业应用至关重要，因为它能够减少对特定pH条件的依赖，从而提高操作的灵活性。

为了进一步评估Bs-CALB的重复使用性能，我们进行了12次循环实验，每次实验在37°C和pH 8.0条件下进行，持续20分钟。在每次循环后，通过离心和洗涤步骤回收细胞，并在新鲜反应混合物中进行下一次循环。结果显示，Bs-CALB在九次循环后仍能保留约50%的初始活性，而在第十二次循环后下降至约25%。这种高重复使用性对于工业应用非常重要，因为它可以显著降低酶的使用成本。

为了评估Bs-CALB的长期储存稳定性，我们在4°C下储存了8周，并每周测量其活性。结果显示，Bs-CALB在储存期间保持了良好的活性，特别是在前四周内，活性下降至约50%，而在八周后仍能维持约50%的初始活性。相比之下，游离的CALB在第三周后活性下降至约40%，并在第八周时进一步降至约27%。这种稳定性使得Bs-CALB成为一种理想的工业催化剂。

### 实验结果与讨论

通过SDS-PAGE分析，我们确认了Bs-CALB在细胞壁上的成功表达。在**B. subtilis**细胞壁中，我们观察到一个约33 kDa的蛋白条带，而对照组中未检测到该条带，表明CALB已成功固定在细胞壁上。我们还通过**p-nitrophenyl butyrate**（p-NPB）的水解反应评估了酶的活性。结果表明，Bs-CALB在所有测试条件下均表现出显著的催化活性，尤其是在37°C和pH 8.0时达到最佳性能。

我们进一步估计了Bs-CALB在**B. subtilis**表面的表达量。通过将整个细胞的活性数据与游离CALB的比活数据进行比较，我们计算出Bs-CALB的表达量约为18.7 μg/g干重（DCW）。这一数值与已知的其他微生物展示系统（如在**Pichia pastoris**中展示的CALB）相比具有竞争力。此外，我们还评估了Bs-CALB在不同温度下的稳定性，发现其在37°C时保持93.7%的活性，而在40°C、45°C和50°C时分别下降至50.3%、23.1%和5.6%。这表明，通过sortase介导的固定，酶的活性得到了显著提升，特别是在高温条件下。

在pH稳定性方面，Bs-CALB在pH 4.5至9.5的范围内均表现出良好的活性，其中在pH 8.0时达到最高值（94.2%的初始活性）。相比之下，游离的CALB在pH 4.5时仅能保留50.1%的活性，而在pH 9.5时为60.3%。这表明，表面固定显著提高了酶在不同pH条件下的稳定性。

为了进一步验证Bs-CALB的催化性能，我们还进行了鱼油水解实验。在25°C和40°C的条件下，Bs-CALB能够选择性地释放EPA和DHA。通过HPLC分析，我们发现Bs-CALB在25°C时的EPA释放量为18.5%±1.2%，而DHA释放量为1.8%±0.2%。而在40°C时，EPA和DHA的释放量分别为5.8%±0.5和1.2%±0.3。这种选择性表明，Bs-CALB在特定条件下能够高效地催化特定底物的水解，为工业应用提供了新的可能性。

### 与其他酶固定方法的比较

在比较不同酶固定方法时，我们发现sortase介导的固定技术在多个方面具有显著优势。与传统的物理吸附、化学交联和包埋方法相比，sortase介导的固定技术能够实现酶的共价连接，从而显著减少酶的流失。物理吸附依赖于弱的非共价结合，导致酶在重复使用过程中大量流失。而化学交联则使用有毒的交联剂（如戊二醛或EDC/NHS），可能改变酶的构象，从而降低其活性。此外，化学交联通常需要多步纯化过程，增加了成本和生物相容性风险。

相比之下，sortase介导的固定技术利用细胞壁的天然结构，实现了酶的特异性锚定，同时避免了额外的纯化和交联步骤。这种技术不仅提高了酶的活性和稳定性，还简化了生产流程，使其更适合工业应用。此外，sortase介导的固定技术还能够实现酶的动态控制，例如通过调节水凝胶的交联度，从而提高催化效率。

在实际应用中，Bs-CALB表现出的稳定性、重复使用性和生物相容性使其成为一种理想的工业催化剂。通过在**B. subtilis**表面展示CALB，我们不仅避免了传统方法中的复杂步骤，还确保了酶的活性不受外界环境的干扰。这种技术的可扩展性和成本效益，使其在生物催化领域具有广泛的应用前景。

### 结论

本研究成功展示了如何利用sortase介导的固定技术将CALB固定在**Bacillus subtilis**细胞表面，从而开发出一种新型的全细胞生物催化剂。实验数据表明，Bs-CALB在37°C和pH 8.0条件下表现出最佳的催化活性，并在九次重复使用后仍能保留约50%的活性，储存八周后仍保持超过50%的初始活性。这种稳定性使Bs-CALB成为工业应用的理想选择，特别是在食品加工、制药和生物燃料生产等领域。

此外，**B. subtilis**作为一种被广泛接受的生物安全菌株，其GRAS（一般认为安全）地位和QPS（合格假设安全）状态，使得Bs-CALB在制药和食品工业中的应用更加可行。该研究不仅为酶固定技术提供了新的思路，还展示了其在实际应用中的潜力。通过sortase介导的固定，我们成功实现了CALB的稳定展示，并验证了其在不同条件下的性能。

综上所述，本研究为生物催化领域提供了一种高效、稳定且环保的酶固定方法。通过将CALB固定在**B. subtilis**细胞表面，我们不仅提高了其热稳定性和pH稳定性，还增强了其重复使用性和生物相容性。这些特性使Bs-CALB成为一种具有广阔应用前景的全细胞生物催化剂，有望在未来的工业生产中发挥重要作用。