MALDI-TOF NAMS的多重检测及其在猪腹泻病原体中的应用

《Microbiology Spectrum》：Multiplex detection and application of MALDI-TOF NAMS for porcine diarrheal pathogens

猪腹泻混合感染中，基于MALDI-TOF NAMS技术的多重PCR检测方法可高效、特异地同时鉴定8种主要病原体，灵敏度达12.2-33.6拷贝/μL，与qPCR验证符合率达96.2%，适用于复杂样本的快速筛查与流行病学监测。

　　在当今的畜牧业中，猪的腹泻性疾病一直是影响动物健康和生产效益的重要问题。这类疾病通常由多种病毒和细菌的混合感染引起，给诊断带来了极大的挑战。由于临床症状之间的重叠以及混合感染的复杂性，传统的单靶点检测方法往往难以满足快速、准确识别主要病原体的需求。此外，某些病原体如甲型肝炎病毒（HEV）和猪细小病毒（PBoV）的潜在人畜共通性也进一步凸显了开发可靠、高通量检测方法的重要性。为应对这一挑战，研究团队开发了一种基于质谱技术的多重检测方法——矩阵辅助激光解吸电离飞行时间核酸质谱（MALDI-TOF NAMS），用于同时检测八种主要与猪腹泻相关的病原体，包括猪流行腹泻病毒（PEDV）、传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）、猪轮状病毒（PoRV）、猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）、猪细小病毒（PBoV）、甲型肝炎病毒（HEV）以及沙门氏菌（Salmonella）。这一技术不仅能够提高检测的灵敏度和特异性，还能在复杂样本中实现高通量的多重病原体识别，为猪腹泻的诊断提供了新的解决方案。

本研究的创新之处在于，它利用了多重聚合酶链式反应（PCR）和单碱基延伸策略，使检测过程更加高效和精确。通过这种方式，研究人员能够在一次实验中同时分析多种病原体，这在处理混合感染情况时尤为重要。实验结果显示，该方法在分析灵敏度方面表现出色，其检测限（LoD）范围在12.20到33.59拷贝/微升之间。同时，分析特异性也得到了验证，没有出现对非目标病原体的交叉反应。在重复性测试中，无论高、中、低浓度样本，检测率均为100%。而在242份临床样本的验证过程中，该方法的敏感性和特异性分别为98.3%和99.5%，整体一致性达到了96.2%。这些结果表明，MALDI-TOF NAMS不仅具备高灵敏度和高特异性，而且能够处理大量样本，为猪腹泻的快速诊断提供了重要工具。

此外，本研究还探讨了该方法在不同样本类型中的表现。实验样本包括粪便、组织和血清，涵盖了多种可能的病原体来源。结果显示，大多数样本中存在多重感染，其中粪便样本中超过60%的阳性样本同时检测到了多种病原体，而组织和血清样本的多重感染比例也相对较高。值得注意的是，HEV和沙门氏菌在多重感染中被特别检测到，这可能意味着它们在加重疾病严重性方面起到了一定的作用。同时，PBoV在与PDCoV、PoRV和PEDV等其他病原体的共感染中表现突出，这表明PBoV在猪腹泻的发生中扮演了重要角色。此外，PBoV的G1、G2和G3基因型在检测中被成功区分，这有助于进一步了解其在不同猪群中的分布情况。

研究还揭示了不同病原体在猪腹泻中的检测频率。其中，PEDV的阳性率最高，达到了40.9%，这与其在猪腹泻中的主要致病作用相吻合。相比之下，SADS-CoV的检测频率较低，仅占5.8%，这可能与其在特定地区的分布有关。而TGEV的检测率则为0%，这与TGEV在猪群中的流行情况变化以及其自然缺失变异株PRCV的广泛传播密切相关。PDCoV和PoRV则在粪便样本中检测频率较高，但它们的感染通常不单独发生，而是与其他病原体共存。这些发现表明，猪腹泻的发生往往是多种病原体共同作用的结果，而单一病原体的检测可能无法全面反映疾病的真实情况。

研究团队还通过实验验证了该方法在临床样本中的应用价值。他们将MALDI-TOF NAMS与实时定量PCR（qPCR）进行了比较，结果表明两种方法在大多数情况下能够达成一致，特别是在检测多个病原体时。此外，研究还发现，对于某些病原体如HEV和PBoV，其在混合感染中的检测频率显著高于健康猪群，这提示它们可能在疾病的发展过程中起到辅助作用。同时，PBoV的基因型多样性也得到了证实，表明其在猪群中可能存在广泛的交叉感染现象。这种多样性不仅影响了疾病的表现形式，也可能与病原体的传播和变异有关。

从更广泛的角度来看，该研究强调了“一个健康”理念的重要性。猪腹泻不仅影响动物健康，还可能通过粪-口途径传播给人类，对公共卫生构成威胁。因此，综合性的病原体检测对于疫情监控、控制和疫苗策略的制定至关重要。研究团队的MALDI-TOF NAMS方法在这一方面展现了其独特的优势，能够同时检测病毒和细菌，为未知病因的腹泻病例提供更全面的诊断依据。

在实际应用中，MALDI-TOF NAMS的优势在于其高通量和快速性，这使其成为传统检测方法的重要补充。尽管当前的质谱设备仍较为大型且主要用于实验室环境，但未来随着微型化技术的发展，该方法有望在资源有限的地区和现场应用中发挥更大作用。此外，该方法在样本处理和分析过程中的成本效益也值得关注，特别是在大规模检测和病原体谱系扩展方面，其经济性和可扩展性为实际应用提供了更多可能性。

综上所述，这项研究不仅展示了MALDI-TOF NAMS在猪腹泻病原体检测中的高效性和准确性，还为未来的研究和应用提供了重要的基础。通过这种技术，研究人员能够更全面地了解猪腹泻的病因，从而为疾病防控、公共卫生安全以及国际贸易中的生物安全提供有力支持。此外，该方法在处理复杂混合感染样本时表现出色，为实现快速、准确的病原体识别提供了新的工具。随着技术的不断进步和应用的不断拓展，MALDI-TOF NAMS有望成为猪腹泻诊断领域的重要手段，为全球畜牧业的可持续发展贡献力量。