用于可靠检测和分型携带mcr、erm、mph和lnu抗生素抗性基因的短读长序列的ROcker模型

《Microbiology Spectrum》：ROCker models for reliable detection and typing of short-read sequences carrying mcr, erm, mph, and lnu antibiotic resistance genes

抗生素耐药基因（ARGs）的定量监测是当前公共卫生监测的重要挑战。本研究开发了针对mcr、mph、erm和lnu四大ARG家族的九种ROCker新型生物信息学模型，通过动态阈值优化基因分类。实验表明，在250bp短读数据中，ROCker模型F1分数比传统方法（BLASTx、HMM）高31%，假阳性率降低30%，假阴性率降低16%。模型显著提升了短读测序中ARGs的检测精度，解决了非目标蛋白共享功能域导致的误判问题，为环境样本和临床样本的耐药基因监测提供了高效工具。

　　在当今全球范围内，抗生素耐药性已成为影响人类和动物健康的重要问题。据报告，仅在美国，每年就有超过280万例抗生素耐药性感染，导致超过3.5万人死亡。抗生素耐药性基因（ARGs）的检测和监控对于评估公共卫生风险至关重要。然而，传统的ARGs检测方法在处理短读长序列数据时面临诸多挑战。短读长序列在未组装的情况下，无法直接通过基因预测或注释来识别特定的耐药性基因，这限制了其在复杂微生物群落中的应用。因此，开发一种能够高效、准确地检测和分类这些基因的新方法变得尤为迫切。

本文介绍了一种名为ROCker的新型生物信息学工具，旨在解决短读长序列中ARGs检测的问题。ROCker模型通过动态调整位点特异性位分值（bit score）阈值，显著提高了检测的准确性，同时降低了假阳性率和假阴性率。这种模型特别适用于mcr、mph、erm和lnu等ARGs家族及其特定变体，如mcr-1、mphA、ermB、lnuF、lnuB和lnuG。通过结合最新的ROCker V2流程，研究团队构建了九个ROCker模型，并对其进行了广泛的测试和验证。这些模型不仅提升了ARGs的检测性能，还为未组装的短读长序列提供了更可靠的分类和量化手段。

在实际应用中，ROCker模型能够处理多种数据类型，包括宏基因组、宏转录组以及PCR扩增子数据。这些数据通常来自于不同的环境或临床样本，而传统的静态过滤方法（如BLASTx和隐马尔可夫模型）在处理这类数据时往往存在较大的不确定性，导致假阳性或假阴性结果的频率较高。相比之下，ROCker模型通过动态阈值调整，能够在不同读长下保持较高的检测一致性，从而提供更精确的基因功能识别。

为了验证ROCker模型的有效性，研究团队利用模拟数据集对模型进行了评估。这些数据集来源于携带ARGs的完整基因组序列，并且覆盖了多种常见的读长（100、150、250和300碱基对）。通过将这些模拟数据集与ROCker模型进行比较，结果显示ROCker模型在250碱基对读长下，假阳性率降低了30%，假阴性率降低了16%，并且F1评分提高了10倍以上。这些结果表明，ROCker模型在识别和分类短读长序列中的ARGs方面具有显著优势。

此外，研究团队还注意到，不同ARGs家族在检测过程中表现出不同的挑战。例如，mcr基因家族与eptA基因存在较高的序列相似性，这使得在未组装的短读长数据中难以区分两者。因此，在构建ROCker模型时，必须考虑这些潜在的干扰因素，并通过精心选择的正向和负向参考序列来提高模型的鲁棒性。同样，mph、erm和lnu基因家族的检测也面临类似的挑战，但ROCker模型在这些基因家族中的表现同样优异。

为了进一步提升ROCker模型的性能，研究团队引入了新的自动化流程，包括ROCkIn和ROCkOut模块。ROCkIn用于获取和筛选参考序列，而ROCkOut则用于构建、优化和测试模型。这一流程不仅提高了模型开发的效率，还减少了人为错误的可能性。通过使用这些模块，研究团队能够快速生成高质量的模型，并确保其在不同数据集中的适用性。

在实际测试中，ROCker模型被应用于真实的短读长数据集，以评估其在真实环境中的表现。结果表明，模型在实际数据中的假阳性率和假阴性率均低于模拟数据集，这可能是因为真实数据中包含的序列错误和偏差较少。此外，研究团队还发现，一些在模拟数据中被误判为假阴性的读长，在真实数据中却能够被正确识别。这说明ROCker模型在处理真实数据时具有更高的鲁棒性和准确性。

总的来说，ROCker模型为抗生素耐药性基因的检测和监控提供了一种新的解决方案。通过动态调整位点特异性位分值阈值，ROCker能够在复杂的数据环境中更准确地识别ARGs，并显著减少误判的可能性。这一工具不仅适用于宏基因组和宏转录组数据，还能够有效处理PCR扩增子数据，为公共卫生监测和环境研究提供了强有力的支持。随着技术的不断进步，ROCker模型的应用前景将更加广阔，有助于更全面地理解抗生素耐药性的传播和演化过程。