通过表面兼职蛋白增强黏附性和免疫激活作用的核糖体工程改造乳糖酶乳酸菌（Lactaseibacillus rhamnosus GG）

《Microbiology Spectrum》：Ribosome-engineered Lacticaseibacillus rhamnosus GG with enhanced adhesion and immune activation via surface moonlighting proteins

本研究通过核糖体工程（RE）对益生菌乳酸杆菌LGG进行改造，发现RpsL基因K56N突变体显著增强表面蛋白如GAPDH的表达，促进肠道细胞粘附和巨噬细胞TNF-α分泌，同时其外泌体免疫调节活性不同于野生型。实验通过转录组、代谢组及蛋白质组分析验证了RE技术提升益生菌功能的有效性。

　　在当前的研究中，我们探讨了通过一种非基因改造的方法——核糖体工程（Ribosome Engineering, RE）来改良益生菌株LGG（Lacticaseibacillus rhamnosus GG）的潜力。LGG作为一种广泛应用于人类健康和动物生产中的益生菌株，其优良的特性包括抑制致病菌、恢复肠道微生物群、改善上皮屏障功能以及调节免疫反应。然而，即便具备工业应用前景的菌株，也可能因为缺乏特定改进而难以实际应用。因此，开发出具有更强稳健性和功能性的益生菌株是当前研究的重要目标。

核糖体工程是一种通过抗生素处理诱导自发突变的微生物育种策略，这种方法简单、经济且安全，不依赖于特殊设施或设备，避免了转基因技术可能带来的安全风险。我们通过RE技术获得了LGG的多个突变株，并对其中的K56N突变株进行了详细分析。该突变株在细胞表面显示出多种蛋白质，这些蛋白质主要是所谓的“moonlighting”蛋白，即那些通常在细胞内起作用，但在特定条件下也能出现在细胞表面，从而影响宿主-微生物相互作用的蛋白质。这些moonlighting蛋白包括DnaK、GroEL、PyK和GAPDH等，它们不仅增强了细菌对肠道细胞的附着能力，还对巨噬细胞表现出免疫激活作用，通过增加肿瘤坏死因子（TNF-α）的产生，可能促进了宿主的免疫反应。

我们发现，尽管LGG野生型的胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）能够抑制脂多糖（LPS）诱导的TNF-α产生，但K56N突变株的EV则未能表现出这种抑制效果。这一发现表明，K56N突变不仅改变了细胞表面蛋白的表达，还可能通过EV的机制影响宿主的免疫反应。此外，我们通过透射电镜（TEM）观察到K56N的EV体积更小，但数量更多，这可能与其增强的免疫激活特性有关。

在本研究中，我们还对突变株的表面蛋白进行了提取和分析，发现K56N突变株在24小时培养后表现出显著更高的表面蛋白浓度，尤其是GAPDH。这种现象可能与核糖体工程引起的翻译效率提高或通过ABC转运蛋白激活的蛋白质运输有关。我们进一步分析了这些表面蛋白对巨噬细胞的免疫激活作用，发现K56N的表面蛋白能够显著促进TNF-α的产生，而这一效应在ProK处理后消失，这表明这些蛋白的表面暴露是其发挥免疫激活作用的关键因素。

此外，我们通过基因工程技术构建了表达这些潜在免疫调节蛋白的转基因菌株（gmLAB），并发现这些蛋白在被巨噬细胞暴露后能够显著增加TNF-α的分泌。这进一步验证了K56N突变株表面蛋白在免疫调节中的重要作用。值得注意的是，尽管K56N突变株的表面蛋白表现出免疫激活作用，但EVs却表现出不同的功能，这提示我们可能需要进一步研究EVs在宿主-微生物相互作用中的具体作用机制。

在我们的研究中，突变株的形态学特征也发生了变化，K56N和K101E表现出显著的弯曲形态，而K56N的短直径显著大于野生型。这些形态学变化可能影响其与宿主细胞的相互作用，从而增强其益生功能。我们还通过蛋白质组学分析发现，K56N突变株的表面蛋白种类比野生型更丰富，这可能与其增强的免疫激活特性有关。

通过转录组学分析，我们发现K56N突变株在ABC转运蛋白和糖代谢相关基因的表达方面显著增强，这可能解释了其表面蛋白增加的原因。同时，我们通过代谢组学分析发现，K56N突变株在多个代谢物的浓度上显著高于野生型，包括核糖醇-5-磷酸、CTP、CDP等，这些代谢物的变化可能反映了其细胞代谢和蛋白质合成的增强。

总之，本研究揭示了核糖体工程在改良益生菌株中的潜力，特别是K56N突变株在增强细胞表面蛋白表达和免疫激活方面表现出显著优势。这些发现不仅为开发具有增强功能的益生菌株提供了新的思路，也为理解益生菌株与宿主之间的相互作用机制提供了重要的线索。未来的研究可以进一步探索这些突变株的免疫调节功能，并评估其在实际应用中的安全性和有效性。