与野生稻相关的弧菌能促进植物生长，并表现出基因组及表型可塑性，以帮助植物适应环境变化

《mSystems》：Wild rice-associated Vibrio promotes plant growth and exhibits genomic and phenotypic plasticity for plant adaptations

盐生水稻 pokkali中 Vibrio porteresiae MSSRF30的促生机制及基因组特征研究。通过生长实验和基因组测序，发现MSSRF30在缺氮盐碱条件下通过固氮、ACC脱氨酶活性和溶磷作用显著促进水稻生长，并具有植物特异性分泌系统（T3SS）和代谢基因，揭示其适应植物根际环境的基因组演化策略。

　　### 一种新发现的植物相关性 Vibrio 细菌及其在咸水环境中的植物促生特性

Vibrio 是一类重要的海洋异养菌，主要研究其病原性和与海洋生物及人类的共生关系。然而，对于 Vibrio 与植物在咸水环境中的相互作用及其潜在益处的研究仍显不足。为填补这一知识空白，本研究聚焦于 Vibrio porteresiae MSSRF30? 和在咸水环境中生长的 Pokkali 稻米，以探讨其在植物生长中的积极作用。MSSRF30? 表现出多种植物有益特性，包括固氮、1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶的产生以及锌和三钙磷酸盐（TCP）的溶解能力。此外，MSSRF30? 能够高效定植于宿主根部，并显著提高 Pokkali 稻米在氮素充足和限制的咸水条件下的生长表现，这表明其具有植物促生能力，这一特性在 Vibrio 中尚未得到充分认识。同时，MSSRF30? 能够利用来自植物根部的各种碳源丰富的底物，展示了其代谢适应性，以在植物根际微环境中生存和繁衍。

通过植物体内根部转录组分析和全基因组测序，我们首次揭示了 MSSRF30? 与 Pokkali 稻米在咸水条件下的相互作用机制。此外，我们还识别了多个与植物相关生活方式相关的基因组特征，这些特征在 Vibrio 属中此前未被报道。这些特征包括植物扩张素、PEP-CTERM 表面锚定与胞外多糖、植物相关 Hrp 型 III 型分泌系统（T3SS）、ACC 脱氨酶产生、PQQ 独立的葡萄糖脱氢酶途径用于磷酸盐溶解、植物来源的糖/有机酸利用操纵子、碳水化合物利用位点以及特定的植物降解 CAZymes。值得注意的是，MSSRF30? 缺乏关键的与动物相关性特征，这突显了其在植物生态位中的特化适应。本研究为 Vibrio 生物学领域增添了新的知识，尤其是在 Vibrio 与植物的有益相互作用方面，这种关系在很大程度上仍未被充分研究。

### 研究的重要性

Vibrio 属包含超过 150 种海洋异养菌，其中许多是机会性病原菌，影响人类和海洋动物的健康。然而，大多数研究集中于导致严重疾病的 Vibrio 种类，如引起霍乱的 Vibrio cholerae 和引起虾类感染的 Vibrio harveyi、Vibrio anguillarum、Vibrio alginolyticus、Vibrio penaeicida 和 Vibrio parahaemolyticus。相比之下，与植物相互作用的 Vibrio 种类及其功能适应性尚未受到足够关注。本研究聚焦于 Vibrio porteresiae MSSRF30? 与咸水生长的 Pokkali 稻米之间的关系。我们发现 MSSRF30? 拥有多种植物促生特性，能够有效定植于根部，并在咸水条件下促进植物生长。此外，MSSRF30? 拥有多个与植物-微生物相互作用常见的基因组特征，这些特征在 Vibrio 种类中尚未被报道，并且缺乏与动物相关性的特征，表明其特化适应于植物环境。这是首次研究 Vibrio 与植物之间的有益相互作用，强调了 Vibrio 在促进植物生长和健康方面的重要作用，尤其是在咸水环境中。

### 研究背景与意义

植物相关的细菌通常通过提供关键营养元素、控制植物病原体和增强植物对非生物胁迫的适应性来促进植物生长。这些有益的相互作用有时还能提高植物的健康状况和生产力，因此对各种植物的植物相关细菌进行研究具有重要意义。目前，我们对植物-细菌有益相互作用的理解大多来自于陆地植物和其根际细菌的研究。相比之下，咸水环境中的植物-细菌有益相互作用的研究则较为有限。咸水环境是海洋和陆地环境之间的过渡带，对农业具有重要意义。因此，探索这些环境中的微生物及其与植物的相互作用，对于提高作物生产力和可持续农业实践具有潜在价值。

在沿海农业研究中，我们进行了 16S rRNA 的宏基因组分析，特别关注了传统上在印度卡纳塔克邦 Kumta 的咸水环境中种植的耐盐水稻品种 Kagga 的根部微生物群落。令人惊讶的是，我们的分析显示 Kagga 稻米的宏基因组数据集中 Vibrio 特异性操作分类单元（OTUs）的丰度较高。值得注意的是，这些 Vibrio 特异性 OTUs 在稻米根部（1.98%）的富集程度显著高于根际（0.9%），这表明 Vibrio 种类与植物宿主之间存在一种密切但尚未明确的相互作用。此外，多项文化独立和文化依赖的细菌群落研究也报告了多种 Vibrio 种类在盐沼植物、红树林和海草根部和根际的频繁出现和高丰度。其中一些 Vibrio 分离株被分类为新物种，如 Vibrio rhizosphaerae、Vibrio porteresiae、Vibrio mangrovi 和 Vibrio plantisponsor，这些菌株是从红树林相关的野生水稻（Porteresia coarctata）的根部和根际、叶部以及根部分离得到的。这些发现表明，Vibrio 种类与植物之间的相互作用在咸水环境中广泛存在。然而，关于 Vibrio 种类在咸水环境中如何促进植物生长及其具体适应机制仍知之甚少。

### 研究结果与讨论

MSSRF30? 在咸水条件下显著促进 Pokkali 稻米的生长。我们首先评估了 MSSRF30? 在盐耐受 Pokkali 稻米中的植物生长介导能力。将三日龄的无菌萌发 Pokkali 种子用 MSSRF30? 细胞悬液（≥10? 个细胞）处理一小时后，将种子无菌转移到含有无菌滤纸的培养皿中。为了维持咸水环境，使用含有 20% 天然海水的无菌植物营养液定期湿润滤纸。经过 10 天的培养后，与未处理对照相比，MSSRF30? 处理的种子在总生物量（P 值 = 6.1e-09）和根长（P 值 = 0.00024）方面显著增加（见图 1a）。类似的结果在重复实验中也得到了验证（数据未显示）。随后，我们在花盆中进行了植物生长实验，使用无菌蛭石-石英砂混合物（2:1）作为生长基质。按照之前描述的方法进行接种，稻米在 PN-N?-20%NSW 中生长。经过 20 天的培养后，MSSRF30? 处理的植物在总生物量、根重、根长和侧根数量方面显著增加，与 UW4、热杀死细胞悬液和未接种对照相比（见图 1b 和 c）。这些结果表明，MSSRF30? 具有在咸水条件下促进 Pokkali 稻米生长的能力。

此外，MSSRF30? 能够固氮，并在氮限制的咸水条件下进一步促进 Pokkali 稻米的生长。为此，我们使用了与之前实验相似的实验设置，但将稻米种植在不含氮的 PN-N?-20%NSW 中。结果显示，与未处理对照相比，MSSRF30? 处理的植物在地上部生物量、地上部长度和地上部氮含量方面显著提高（见图 2a 和 b），这表明 MSSRF30? 通过固氮促进 Pokkali 稻米的生长。为了支持这一观点，我们在氮限制和氮充足条件下对植物体内 nifH 基因的表达进行了半定量分析。结果表明，MSSRF30? 的 nifH 转录物在氮限制条件下被检测到，但在氮充足条件下未被检测到（见图 2c）。这表明 MSSRF30? 能够在 Pokkali 稻米根部主动表达 nifH 基因，并根据其生长环境中的氮含量调节其表达。

MSSRF30? 还能够溶解不溶性无机锌和 TCP，将其转化为可溶性形式，通过产生葡萄糖酸来酸化培养基（见图 2d 和 e；图 S1a 和 b）。此外，MSSRF30? 产生 ACC 脱氨酶（见图 2f 和 g；图 S1c 和 d），这是一种调节植物应激乙烯并促进植物在非生物胁迫下生长的重要酶。值得注意的是，这些发现表明 MSSRF30? 拥有独特的植物促生特性，这些特性在 Vibrio 属中尚未被充分记录。此外，MSSRF30? 处理的植物在咸水条件下的生长促进可能归因于其多种植物促生特性。类似的结果已在多种陆地植物相关 PGPR 中被报道。

接下来，我们研究了 MSSRF30? 的根部定植能力，这是其与植物相互作用的重要指标，很少在 Vibrio 属中被研究。Pokkali 稻米幼苗在 clerigel 中培养至七天后，无菌转移到含有 PN-N?-20%NSW 的无菌植物培养皿中进行分析。在该设置中加入 MSSRF30? 细胞，并在不同时间点收集根部，使用两种方法量化 MSSRF30?：一是针对 MSSRF30? 特异性 pyrH 基因的 qPCR，二是通过标准的系列稀释平板法回收 MSSRF30? 细胞。在无菌条件下生长的植物每隔四天收获一次，结果显示 MSSRF30? 的定植量在 12 天内增加，达到每克新鲜根重 10 个对数单位的菌落形成单位（CFU）（见图 2h）。通过 qPCR 量化显示，该基因在 12 天内显著增加，且在不同采样点之间存在显著差异（见图 2i）。两种方法的结果表明，MSSRF30? 细胞数量在接种后 0 天到 12 天显著增加，包括一个持续 20 天的扩展实验（见图 2j）。此外，通过使用 GFP 标记的 MSSRF30? 进行共聚焦激光扫描显微镜检查，发现 MSSRF30? 定植于根部，特别是在根部成熟区的细胞间隙、根毛、以及侧根的细胞间隙和侧根生长点（见图 2k 和 l、m、n、o 和 p；电影 S1）。这种定植模式与已知的植物相关 PGPR 相似。此外，通过测定表面灭菌后的根部 CFU 数量，揭示了 MSSRF30? 的内生特性（见图 2q）。总体而言，这些结果表明 MSSRF30? 能够高效地与 Pokkali 稻米根部相互作用并繁殖。

### 基因组特征

我们对 MSSRF30? 的完整基因组进行了测序和注释，以理解其有益植物生长特性的基因基础。该基因组大小为 5,498,609 个碱基对，GC 含量为 44.8%，由两个染色体组成，不含质粒（见表 S1a）。为了评估 MSSRF30? 的基因组组成如何反映其对植物相关生活方式的适应性，我们分析了 RAST 服务器上 MSSRF30? 的子系统特征，并将其与动物相关 Vibrio 进行比较。该分析显示，大量蛋白质编码基因被归类为代谢功能，包括与氨基酸运输和代谢、碳水化合物运输和代谢以及无机物运输和代谢相关的基因（见表 S1b）。这些发现表明，MSSRF30? 具有专门的适应性，用于代谢各种植物来源的底物，这一特性在植物相关根际细菌的基因组中常被观察到。

### 与植物相关生活方式的基因组信息

#### 植物生长功能

##### 氮固定

MSSRF30? 能够在氮限制的咸水条件下促进植物生长并固定大气氮（见图 2a 和 b）。因此，MSSRF30? 拥有完整的氮固定遗传系统（nif），包括 19 个 nif 基因，编码在 31.87 kb 区域内，并分布在第二染色体上的三个基因簇中（见图 3）。簇一包含主要参与氮酶电子传递的基因（nifF、rnfABCDGEH 和 fdxN）以及 nif 调节基因（nifAL）。簇二包含编码钼铁依赖性氮酶复合物的主要基因（nifHDK）、钼铁辅因子（FeMo-co）生物合成（nifYENXUSV）以及氮酶成熟（nifMZ）相关的基因。簇三编码主要参与钼向氮酶运输的基因（modABC）。其他参与氮固定的基因如表 S1c 所示。

MSSRF30? 的一般 nif 组织（簇一和簇二）与 Azotobacter vinelandii DJ 和 Pseudomonas stutzeri A1501 的 nif 遗传系统相似。值得注意的是，DJ 和 A1501 的核心 nif 基因之间发现的其他蛋白编码基因在 MSSRF30? 中缺失，这表明 MSSRF30? 可能只涉及有限的 nif 相关基因进行氮固定，考虑到这一过程的较高能量成本。支持这一观点，我们的 MSSRF30? 在体外氮缺乏条件下的转录组分析显示，与簇一和簇二相关的所有 nif 基因都显著转录（见表 1），表明它们可能参与氮固定。

##### ACC 脱氨酶

MSSRF30? 对 ACC 利用和 ACC 脱氨酶产生呈阳性（见图 2f 和 g）。因此，MSSRF30? 基因组携带编码 ACC 脱氨酶合成（acdS 基因，WP_261892913.1）和正向转录调控（acdR 基因，属于亮氨酸反应调节蛋白家族，WP_261892914.1）的基因，这是 Vibrio 属中未报告的遗传特征。如其他 acdS 阳性革兰氏阴性植物相关根际细菌的基因组所示（见文献 45 和 46），acdR 基因在 acdS 基因旁边。此外，在 acdS-acdR 基因位点附近或其侧翼区域未发现移动遗传元件，如转座酶或整合酶，这表明 acdS 在 MSSRF30? 中未经历最近的水平基因转移。此外，acdS 在 MSSRF30? 中的正向获得可能是由于其长期适应植物生长环境，其中 acdS 的表达可能在非生物胁迫下对植物的互惠关系起重要作用。支持这一观点，大多数动物、珊瑚和藻类相关 Vibrio 基因组中未发现 acdS 基因（数据未显示），并且在 MSSRF30? 在早期 Pokkali 稻米根部定植期间，acdS 基因表达显著增加（log2 FC = 3.26）（见图 S2；表 S2）。此外，MSSRF30? 在测试的氮限制咸水条件下促进 Pokkali 稻米生长（见图 2a 和 b）。这些结果表明，acdS 在 MSSRF30? 中可能是功能性的，并在氮缺乏的咸水生长环境中对植物宿主的相互作用起关键作用。

##### 无机磷酸盐溶解

葡萄糖酸和 2-酮葡萄糖酸是农业土壤中与无机 TCP 溶解相关的两种重要有机酸。MSSRF30? 能够通过分泌葡萄糖酸将不溶性 TCP 转化为可溶性形式，从而增强细胞外介质中的磷可用性（见图 2e；图 S1a 和 b），这是一种在 Vibrio 属中尚未报道的潜在 PGPR 特性。与这一发现一致，MSSRF30? 基因组中携带潜在的酶（见表 S1e），包括 FAD 依赖的葡萄糖脱氢酶，属于葡萄糖-甲醇-胆碱（GMC）氧化还原酶超家族（三个拷贝）以及参与葡萄糖氧化为葡萄糖内酯再转化为葡萄糖酸的葡萄糖内酯酶。此外，每个 GMC 氧化还原酶旁边都存在 C 型细胞色素，这是一种红ox活性含血红素的蛋白质（三个拷贝），表明其可能在 GMC 氧化还原酶的正常功能中起作用。还发现了两个膜结合的葡萄糖酸脱氢酶，它们催化葡萄糖酸转化为 2-酮葡萄糖酸。更重要的是，MSSRF30? 中未编码 PQQ 依赖的胞外葡萄糖脱氢酶或促进葡萄糖直接氧化为葡萄糖酸的 PQQ 辅因子编码基因，这些基因在多种已知高效的 TCP 溶解根际细菌（如 Pseudomonas 和 Burkholderia）中被发现（见文献 49 和 50）。令人惊讶的是，FAD 依赖的葡萄糖脱氢酶在多个 Vibrio 基因组中缺失（数据未显示）。这些基因组发现表明，MSSRF30? 可能依赖于 PQQ 独立的葡萄糖脱氢酶途径（即 FAD 依赖的葡萄糖脱氢酶）来从葡萄糖生成葡萄糖酸并溶解不溶性 TCP。类似的研究在 Collimonas pratensis PMB3 中也有所报道（见文献 51）。

#### 分泌系统

MSSRF30? 的基因组携带两个专门的蛋白质转运分泌系统，即 III 型（T3SS）和 VI 型（T6SS）分泌系统及其相应的效应蛋白。这一发现可能表明 MSSRF30? 具有介导特定植物宿主相互作用并干扰真核和原核细胞功能的潜力，如文献 52 和 53 所述。

##### T3SS

MSSRF30? 拥有 31 个基因，组织在一个单个的大基因簇中，位于第二染色体上，以及一个在第一染色体上编码 T3SS 的孤儿基因（见图 4a；表 S1f）。重要的是，这个 T3SS 基因簇与已知植物病原体的超敏感反应和病原性（hrp）装置共享更高的序列同源性和基因排列，而不是动物/人类病原体的注射器。此外，T3SS 外膜分泌组分（SctC）的系统发育分析显示，MSSRF30? 的 T3SS 形成一个独特的分支，与多个植物相关根际细菌（包括已知植物病原体和植物促生菌）的 T3SS 集群分离，与动物和人类病原体的 T3SS 集群关系较远（见图 4b）。这些结果表明，MSSRF30? 的 T3SS 可能代表一个尚未描述的新的植物病原体 Hrp 型 T3SS 家族成员，并且是一个在海洋 Vibrio 中未报告的基因组特征。值得注意的是，在 T3SS 基因簇中，预测了重复外基因回文（REP）相关的酪氨酸转座酶（RAYT，WP_261893332.1），位于 avrE 和 hrpE 之间，这表明 MSSRF30? 可能通过水平基因转移获得了 T3SS 位点。研究表明，T3SS 在维持细菌与真核宿主的病原性或共生关系中起着至关重要的作用（见文献 52）。MSSRF30? 拥有多种 PGPR 特性，并在氮限制的咸水条件下促进 Pokkali 稻米生长（见图 2a 和 b），这表明 T3SS 可能在 MSSRF30? 与植物的相互作用中发挥作用，如 T3SS 相关的 PGPR 所示（见文献 53–56）。

##### T6SS

MSSRF30? 基因组编码了一个完整的 T6SS 相关基因组，组织为一个大基因簇和两个辅助基因簇，Aux-1 和 Aux-2（见图 5a）。大基因簇编码 T6SS 的主要结构成分，包括调控蛋白和两个辅助基因簇，每个编码 Hcp 蛋白（Hcp1 或 Hcp3）（见图 5a；表 S1g）。此外，所有三个基因簇还包含编码不同 VgrG 蛋白的基因，这些蛋白是 T6SS 的核心成分，以及不同的效应蛋白。值得注意的是，两个 T6SS 核心效应蛋白，即含有脯氨酸-丙氨酸-丙氨酸-精氨酸（PAAR）重复的蛋白（PAAR-1，WP_261892817 和 PAAR-2，WP_261896979.1）以及 Hcp2（WP_26189022.1）位于 T6SS 基因簇之外。主要的 T6SS 装置与 Vibrio cholerae 非常相似（数据未显示）。然而，它们缺乏在 C 末端域中编码的多形性抗真核毒素，这些毒素在 Vibrio 属的其他成员中被发现（见图 5b）。此外，T6SS 相关基因在 MSSRF30? 的早期根部定植期间被表达（见表 S2；图 S2），这表明 T6SS 在 MSSRF30? 与宿主的相互作用和细菌间竞争中可能发挥重要作用，如文献 57 和 58 所述。

此外，MSSRF30? 的基因组还携带通用分泌（Sec）途径、双精氨酸转运（TAT）途径以及 I 型（T1SS）和 II 型（T2SS）蛋白质分泌系统（见表 S1h），这些系统负责将蛋白质（折叠和未折叠形式）跨过细胞膜并释放到细胞外环境中。

### 与植物相关的生存方式

#### 运动性、趋化性和附着

运动性和趋化性是竞争根表面定植和成功建立宿主关系的前提条件。MSSRF30? 编码完整的旗叶系统（见表 S1j），并且包含三个不同的化学感受系统（簇 I、II 和 III）以及 62 个化学感受器，这比 Vibrio cholerae O1 生物变 El Tor（45 个）、Vibrio vulnificus NBRC 15645（46 个）、Aeromonas fischeri ES114（43 个）、Vibrio harveyi SB1（31 个）和 Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633（30 个）中的化学感受器数量更多。这种较高的化学感受器数量可能表明 MSSRF30? 具有更强的感知和响应其复杂生长环境（即植物根际）变化代谢潜力的能力。为了支持这一观点，我们使用了一个包含两个植物培养皿并由 7–12 微米孔径的 Whatman 滤纸分隔的实验设置（见图 S3a）。结果表明，从根部回收的 MSSRF30? 细胞数量（1.0 ± 0.4 × 10?? CFU/新鲜根克）高于从沙子中回收的细胞数量（1.5 ± 0.3 × 10?? CFU/克），这表明 MSSRF30? 可能利用这些化学感受器来感知和导航其在 Pokkali 稻米根部的运动，从而实现高效的根部定植和建立。类似的研究在宿主相关细菌中也有所报道（见文献 59–63）。

此外，我们还发现了几个负责高效宿主表面附着的基因，包括 IV 型菌毛、甘露糖敏感凝集素（MSHA）、PEP-CTERM 表面锚定与胞外多糖以及表面多糖（见表 S1k）。有趣的是，一种在 Vibrio cholerae O1 生物变 El Tor 和 Aeromonas fischeri ES114 中发现的主要动物肠道定植因子——毒素相关调节菌毛（TCP）在 MSSRF30? 中缺失。此外，动物相关的 Vibrio 基因组缺乏 PEP-CTERM 表面锚定（数据未显示）。值得注意的是，MSSRF30? 编码一种属于扩张素 EXLX1 家族的纤维素结合蛋白（WP_261897435.1），其与植物相关根际细菌（包括有益菌如 Bacillus subtilis 和植物病原体如 Xanthomonas oryzae、Clavibacter michiganensis 和 Ralstonia solanacearum）的 EXLX1 同源物在氨基酸序列上具有 34.75–38.62% 的同源性，这些同源物参与植物定植（见文献 64–66）。重要的是，Vibrio cholerae O1 生物变 El Tor、Vibrio vulnificus NBRC 15645、Aeromonas fischeri ES114、Vibrio harveyi SB1 和 Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633 的基因组中缺乏 EXLX1 同源物。此外，在 MSSRF30? 的早期根部定植过程中，观察到多个 GH 家族、GH1、GH2、GH32、GH43 和 PL 家族（PL1 和 PL9）的基因表达显著上调（见表 S2；图 S2）。类似的研究表明，CAZymes 在根部定植中起作用，如已知的固氮内生菌 Azoarcus BH72 和 Azospirillum brasilense Sp 245 以及生物控制 PGPR Bacillus velezensis GA1 所报道的（见文献 75–78）。

### 结论

通过使用 Vibrio porteresiae MSSRF30?，一种植物相关根际细菌，以及在咸水环境中生长的盐耐受 Pokkali 稻米作为研究系统，我们首次展示了 MSSRF30? 拥有多种植物促生特性，并在咸水条件下显著促进植物生长。此外，根部定植研究进一步确认了 MSSRF30? 在稻米根部高效互动和繁殖。为了揭示这些独特 PGPR 特性的遗传基础，我们对 MSSRF30? 进行了完整的基因组测序。该分析识别了多个与植物相关生活方式相关的基因组特征，这些特征在 Vibrio 属中此前未被报告，其中一些特征在从类似环境分离的 Vibrio 中也被发现（见表 S3）。此外，通过植物体内根部转录组分析，我们展示了这些基因系统在早期根部定植和相互作用中的参与。值得注意的是，MSSRF30? 缺乏关键的与动物相关性特征，这突显了其基因组的可塑性。本研究加深了我们对 Vibrio 生物学的理解，特别是在 Vibrio 与咸水植物的互惠关系方面。目前，我们正在开始研究 Vibrio 在咸水环境中与植物相互作用的复杂机制及其在植物健康和生长中的可能作用。