基于多重RPA/CRISPR-Cas12a集成生物传感器的现场高危HPV基因分型新策略

《Analytica Chimica Acta》：A Novel Multiplex RPA/CRISPR-Cas12a Integrated Biosensor for On-Site Detection of High-Risk HPV Genotypes

本文开发了H-MRC12a集成生物传感器，创新性地结合简并引物与型别特异性crRNA，将多重重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR-Cas12a反式切割活性相整合，可在50分钟内实现8种高危HPV基因型（16/18/31/33/52/53/58/66）的单拷贝灵敏度检测。该平台在37°C等温条件下运行，通过UV激发可视化读值，无需专业设备，临床验证与qPCR结果100%一致，为资源有限地区的宫颈癌筛查提供了突破性分子诊断方案。

　　

亮点

材料与试剂

所有引物、质粒和crRNA均由GENEWIZ公司（中国苏州）合成。FAM-BHQ1双标记单链DNA探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。RPA试剂盒（TwistAmp? Basic Kit，货号239338）购自TwistDX公司。LbaCas12a、稀释液和NEB Buffer 2.1购自New England Biolabs（货号M0653T）。6× DNA上样染料和DNA Marker购自赛默飞世尔科技。人乳头瘤病毒核酸分型试剂盒（注：原文此处未列全，保留原表述）。

H-MRC12a生物传感器的工作原理

为实现高危HPV的快速现场检测，我们开发了H-MRC12a生物传感器——一个整合了RPA与CRISPR-Cas12a技术的集成平台。其设计采用靶向HPV L1基因组保守区域的简并引物，通过优化结合动力学解决了多重扩增中引物竞争难题。同时，系统利用CRISPR-Cas12a的反式切割活性，并配对型别特异性crRNA寡核苷酸，形成构象稳定的crRNA-Cas12a核糖核蛋白复合物。当crRNA识别到目标HPV DNA时，Cas12a被激活并对周围非特异性单链DNA探针（如FAM-BHQ1标记的报告分子）进行"附带切割"，释放荧光信号。通过8通道crRNA-Cas12a-FAM-BHQ1荧光报告系统，在UV激发下实现>7:1的信噪比，肉眼可直接判读结果。

讨论

高危HPV型别的持续感染与宫颈癌发病存在明确致病关系。然而，现有HPV检测方法存在多处短板：杂交捕获技术缺乏分型能力且灵敏度有限；PCR平台虽精准但依赖热循环仪；现有CRISPR检测策略或多重分型能力不足，或无法区分关键亚型。本研究提出的"简并引物+型别特异性crRNA"策略，通过引物简并性与核酸酶特异性的协同作用，为多重病原检测提供了"广谱捕获、精准分型"的通用框架。该平台在50分钟内完成检测，对复杂样本表现稳健，其便携性适配基层医疗场景，有望推动宫颈癌筛查的普惠化进程。

结论

本研究开发的H-MRC12a生物传感器采用双管模块化材料架构，整合了多重RPA-CRISPR/Cas12a系统，突破了传统分子诊断局限。其核心创新包括简并引物库、CRISPR传感元件及UV可视化单元，可在50分钟内完成检测。该平台设计稳健，适用于复杂样本，便携性使其可适配医疗机构、家庭自检及疫情应急场景，为全球公共卫生公平性提供了低成本、高兼容性的分子诊断解决方案。