新型基因工程蛋白水凝胶通过超快交联和强效粘附促进软骨再生

《Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre》：Ultrafast crosslinking, strongly adhesive de novo protein hydrogels promote cartilage regeneration

本研究针对骨关节炎早期浅层软骨缺损修复难题，开发了一种基于基因工程设计的丝素-弹性蛋白(SELP)水凝胶2KY-16。该材料通过酪氨酸残基实现蓝光触发超快交联(<2秒)，借助赖氨酸残基与软骨细胞外基质(ECM)的静电相互作用及RGD基序增强细胞粘附，在兔部分厚度软骨缺损模型中成功促进透明软骨样基质再生，为软骨修复提供了新型单组分材料平台。

　　

骨关节炎（Osteoarthritis, OA）作为一种全球高发的退行性关节疾病，正影响着约5.95亿人口，其早期病理特征表现为浅层软骨损伤。这些损伤不仅形态不规则、深度不一，更因软骨组织固有的无血管特性和低细胞密度，导致自我修复能力极差。当前临床干预手段，无论是保守药物治疗还是手术干预，均难以实现软骨组织的功能性再生。特别是针对部分厚度软骨缺损，传统治疗方法往往创伤大于疗效，开发能够同时满足快速原位成型、强组织粘附力和良好生物相容性的新型修复材料成为迫切需求。

在这一背景下，浙江大学爱丁堡大学联合学院等单位的研究团队在《Bioactive Materials》上发表了创新性研究成果。他们通过合成生物学手段，设计了一种具有超快交联特性和强粘附能力的de novo（从头设计）蛋白水凝胶，为部分厚度软骨缺损的修复提供了新的解决方案。

研究团队采用基因工程技术构建了三种不同分子量和功能基团的丝素-弹性蛋白（Silk-elastin-like proteins, SELPs），分别命名为2Y-5、2KY-5和2KY-16。这些蛋白质通过在弹性蛋白结构域中精确编码酪氨酸（Y）、赖氨酸（K）和RGD功能基序，实现了多功能集成。关键技术方法包括：通过重组DNA技术构建SELP表达质粒并在大肠杆菌中表达纯化；利用Ru/SPS（三(2,2'-联吡啶)氯化钌(II)六水合物/过硫酸钠）光引发系统实现蓝光（450纳米）触发的超快交联；通过扫描电镜、流变学分析和力学测试表征材料性能；采用体外细胞培养和兔部分厚度软骨缺损模型评估生物相容性和修复效果。

3.1. 蛋白设计与SELP水凝胶表征

研究人员通过理性蛋白质设计，在SELP骨架中精确整合了三种功能基序：第五弹性蛋白区块第二位点的酪氨酸残基用于光交联，第一弹性蛋白区块第二位点的赖氨酸残基用于调节表面电荷，以及丝素和弹性蛋白结构域之间插入的GRGDS序列用于促进细胞粘附。2KY-16的分子量经MALDI-TOF MS确认为77.5 kDa。Ru/SPS介导的交联系统使水凝胶在蓝光照射下2秒内完成凝胶化，荧光光谱证实了双酪氨酸键的形成。流变学测试显示2KY-16的储能模量（G'）显著高于其他两组（16.0±1.8 kPa对比较2Y-5的2.1±0.3 kPa），压缩测试表明2KY-16的杨氏模量达到53.5±2.4 kPa，与天然软骨周围基质（PCM）的刚度范围（40-70 kPa）高度匹配。

3.2. SELP水凝胶的粘附性能

2KY-16水凝胶通过双机制粘附实现卓越性能：酪氨酸残基形成双酪氨酸共价键，而赖氨酸残基提供正电荷与带负电的软骨ECM产生静电相互作用。拉剪测试显示2KY-16的粘附强度高达90.8±1.8 kPa，显著优于2Y-5（32.5±1.1 kPa）和2KY-5（42.1±7.1 kPa）。zeta电位分析证实2KY-16表面带正电（+18.1±0.8 mV），而缺乏赖氨酸的对照样品RGD-2Y-16则带负电（-12.9±1.3 mV）且粘附强度降低。细胞实验显示，含有RGD基序的2KY-5和2KY-16能显著促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）和软骨细胞的粘附与铺展。

3.3. SELP粘合剂的体外生物相容性

软骨细胞三维培养实验表明，所有SELP水凝胶组均保持高细胞活性（第21天存活率>82%）。细胞骨架染色显示，2KY-16组中的软骨细胞保持典型的球形形态，而2Y-5组细胞则呈现伸展态。CCK-8实验证实不同浓度的Ru/SPS光引发剂均未表现出明显细胞毒性，证明了该交联系统的生物安全性。

3.4. SELP粘合剂对软骨细胞表型的维持作用

21天培养后，免疫荧光和RT-qPCR分析显示，2KY-16组中软骨生成标志物SOX9、ACAN和COL2的表达显著上调，而肥大化标志物COLX和纤维化标志物COL1的表达受到抑制。阿利新蓝染色显示2KY-16组糖胺聚糖（GAGs）沉积最为丰富，表明其能有效维持软骨细胞表型并促进软骨特异性ECM沉积。

3.5. SELP粘合剂的体内生物相容性

大鼠皮下植入实验表明，2KY-16水凝胶12周后降解缓慢（残留质量45.7%），炎症反应轻微，纤维囊形成较薄，且主要器官未见病理改变，证明了其良好的体内生物安全性和相容性。

3.6. SELP粘合剂的体内评价

兔部分厚度软骨缺损模型显示，2KY-16治疗组在12周时缺损区几乎完全填充，新生组织与周围软骨整合良好，苏木精-伊红（H&E）和沙红O/固绿（SO/Fast green）染色显示大量GAG沉积，免疫组化检测到丰富的II型胶原，天狼星红偏振光显微镜下可见胶原纤维呈现类似天然软骨的垂直取向结构。国际软骨修复协会（ICRS）评分和改良O'Driscoll组织学评分系统（MODS）评分均显著优于其他组别。

该研究成功开发了一种通过基因工程精确设计的蛋白水凝胶2KY-16，其创新性地整合了超快蓝光交联、双重粘附机制（共价锚定和静电相互作用）和细胞粘附功能。研究不仅证明了该材料在体外能有效维持软骨细胞表型，更在动物模型中实现了部分厚度软骨缺损的功能性再生。2KY-16水凝胶作为一种单组分、无细胞材料，通过简单的一步注射-光交联操作即可实现优异修复效果，显示出巨大的临床转化潜力。这项研究凸显了合成生物学在生物材料设计中的强大能力，为软骨修复及其他肌肉骨骼疾病治疗提供了新的技术平台。