聚乙烯亚胺-戊二醛修饰Novozym? 435增强其在木糖基天然低共熔溶剂中的稳定性及糖酯合成效能

《Biomass and Bioenergy》：Polyethylenimine-glutaraldehyde modification of Novozym? 435 enhances stability and sugar ester synthesis in a xylose-based natural deep eutectic solvent

本研究针对传统溶剂中脂肪酶易失活及酶脱附的问题，通过聚乙烯亚胺（PEI）涂层和戊二醛（GA）交联修饰Novozym? 435，显著提升了其在甲基乙基酮（MEK）、叔丁醇（TERT）及木糖基天然低共熔溶剂（NADES）中的稳定性。改性后的生物催化剂在表面活性剂Triton X-100存在下酶泄漏极少，在木糖基NADES中催化油酸与木糖酯化反应转化率提高2.3倍，操作稳定性提升3倍（5次循环后仍保留75%活性）。所得木糖油酸酯具有优于商业表面活性剂的乳化性能，为生物表面活性剂的绿色合成提供了新策略。

　　

在当今追求绿色化学和可持续发展的背景下，生物表面活性剂因其生物可降解性和低毒性而备受关注。糖酯（SEs）作为一类重要的生物表面活性剂，在食品、化妆品和制药工业中具有广泛的应用前景。然而，糖酯的合成面临着一个关键挑战：糖类（如木糖）和脂肪酸（如油酸）的极性差异巨大，难以在传统溶剂中同时溶解。此外，常用的有机溶剂（如离子液体）虽然能提高反应效率，但存在成本高、生物降解性差以及对酶稳定性不利等问题。更棘手的是，商业脂肪酶制剂Novozym? 435（一种固定在丙烯酸树脂上的南极假丝酵母脂肪酶B，CalB）在反应过程中，尤其是在表面活性剂产物存在的环境下，容易从载体上脱附，导致催化剂活性下降和重复使用性降低。

为了解决这些难题，来自巴西圣卡洛斯联邦大学的研究团队在《Biomass and Bioenergy》上发表了一项创新性研究。他们开发了一种简单的修饰策略，通过用聚乙烯亚胺（PEI，一种阳离子聚合物）涂层并随后用戊二醛（GA，一种交联剂）交联来处理Novozym? 435，显著增强了该生物催化剂在苛刻反应环境中的稳定性，并成功将其应用于木糖基天然低共熔溶剂（NADES）中高效合成木糖油酸酯。

为开展研究，研究人员主要运用了几项关键技术：首先，对商业脂肪酶Novozym? 435进行物理化学修饰，包括用不同分子量（2 kDa, 25 kDa, 750 kDa）的PEI涂层以及后续的GA交联处理，制备了一系列改性生物催化剂。其次，通过Rose Bengal染料吸附实验评估了改性前后生物催化剂表面的疏水性变化。第三，利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析了表面活性剂存在下酶的脱附情况。第四，在不同溶剂（甲基乙基酮MEK、叔丁醇TERT、木糖基NADES）中进行了脂肪酶催化的油酸与木糖的酯化反应，并通过气相色谱（GC）监测反应进程。最后，对合成产物进行了分离纯化（硅胶柱色谱）、鉴定（薄层色谱TLC和电喷雾电离-四极杆-飞行时间质谱ESI-QTOF-MS/MS）以及功能评价（乳化指数测定）。

3.1. 不同处理对N435吸附能力和水解活性的影响

通过Rose Bengal染料吸附实验发现，未经修饰的N435具有较强的染料吸附能力。然而，仅用PEI涂层后，吸附量显著下降约80%，这表明PEI的亲水微环境降低了生物催化剂的表面疏水性。有趣的是，当PEI涂层后的催化剂再用GA交联后，染料的吸附量反而比未修饰的N435增加了80%到160%，表明交联过程可能增加了表面的疏水区域。在水解活性方面，单独使用GA交联或使用低分子量PEI（2 kDa, 25 kDa）涂层均导致脂肪酶水解甘油三丁酸酯的活性下降（最高下降74%）。但使用750 kDa的PEI涂层时，水解活性不仅没有下降，反而略有提升（增加9%）。然而，任何PEI涂层后的催化剂再经GA交联，其水解活性均出现显著下降（约56-74%），这可能是由于交联引起的酶分子刚性增加以及底物传质阻力增大所致。

3.2. 在有机溶剂中的稳定性

研究人员评估了改性生物催化剂在60°C下于不同溶剂中孵育6小时后的稳定性。在亲水性有机溶剂甲基乙基酮（MEK）中，经750 kDa PEI涂层的催化剂活性比未处理的N435提高了1.3倍，而后续的GA交联进一步将活性保留率提升了1.92倍。在叔丁醇（TERT）中，大多数PEI处理后的催化剂都能保持初始活性，其中25 kDa PEI处理的催化剂活性有所增加。在木糖基NADES中，PEI处理后的催化剂普遍能保持活性，而经25 kDa和750 kDa PEI处理并GA交联的催化剂在孵育后活性甚至有所增强。这些结果表明，PEI涂层创造了亲水微环境，有效阻隔了溶剂对酶分子的不利影响，而GA交联则通过增加分子刚性进一步稳定了酶结构。

3.3. 在含去污剂介质中的稳定性及酶泄漏

为了模拟表面活性剂产物对催化剂稳定性的影响，研究将催化剂在Triton X-100溶液中孵育。未经修饰的N435孵育1小时后活性下降约30%，SDS-PAGE分析显示有明显的酶蛋白从载体上脱附。仅用PEI涂层的催化剂酶脱附现象更为严重，活性损失达40%。然而，经PEI涂层后再用GA交联的催化剂，特别是使用25 kDa和750 kDa PEI的样品，几乎完全防止了酶的脱附，并且在24小时的长时间孵育中依然保持稳定。这表明GA交联在PEI和酶分子之间形成了牢固的共价连接，成功地将酶不可逆地固定在了载体上。

3.4. 木糖酯合成过程中油酸转化曲线

在木糖油酸酯的合成反应中，比较了未修饰N435和经750 kDa PEI及GA处理的N435-PEI750-GA的性能。在MEK和TERT中，N435-PEI750-GA催化油酸消耗的初始速率更高。反应24小时后，在TERT和木糖基NADES中，N435-PEI750-GA的油酸转化率比未处理N435高约1.6倍；在MEK中，这一优势更加明显，达到2.3倍。值得注意的是，在所有溶剂中，N435-PEI750-GA都实现了更高的最终转化率（MEK中约40%，TERT和NADES中约30%），这超过了理论上仅生成木糖单酯所能达到的转化率（约20%），暗示生成了单酯、二酯和三酯的混合物。薄层色谱（TLC）分析证实了酯类产物的形成。

3.5. 最终产物的表征

通过柱色谱分离和质谱（ESI-QTOF-MS/MS）分析，确认在MEK、TERT和木糖基NADES中，均成功合成了木糖单油酸酯（m/z 413.29）、木糖二油酸酯（m/z 677.54）和木糖三油酸酯（m/z 941.78）。特别的是，当使用木糖基NADES（由木糖和氯化胆碱组成）作为溶剂时，质谱还检测到了胆碱油酸酯（m/z 367.35）的形成，这表明NADES中的胆碱组分也参与了酯化反应。乳化指数（EI）测定表明，由N435-PEI750-GA在MEK和木糖基NADES中催化合成的产物，其乳化能力是未处理N435催化产物的5倍左右。在TERT中，两种催化剂产生的产物乳化指数无显著差异，且均高于商业表面活性剂蔗糖月桂酸单酯（EI = 12%），显示出良好的应用潜力。

3.6. 生物催化剂在木糖油酸酯合成中的操作稳定性

最后，研究人员评估了生物催化剂在木糖基NADES中连续使用5个批次（每批6小时）的稳定性。未修饰的N435在5个循环后活性仅保留21%。相比之下，N435-PEI750-GA表现出卓越的稳定性，5次循环后仍能保持75%的相对转化率，稳定性提高了约3倍。循环使用后对催化剂的Rose Bengal吸附能力测试显示，未处理N435的吸附能力增加了1.8倍，可能源于酶脱附后载体疏水基团的暴露或油酸的吸附；而N435-PEI750-GA的吸附能力没有变化，证明修饰处理有效保护了催化剂表面。

综上所述，本研究成功地开发了一种通过PEI涂层和GA交联增强Novozym? 435稳定性的有效策略。改性后的生物催化剂N435-PEI750-GA在多种有机溶剂和新兴的绿色溶剂NADES中均表现出更高的稳定性和催化效率，特别是在其自身催化产生的表面活性剂环境中抗脱附能力显著增强。该研究不仅提供了一种性能更优的生物催化剂，还凸显了木糖基NADES作为一种绿色、可持续反应介质的巨大潜力，它既能作为溶剂，又能作为反应物，为利用木质纤维素生物质（如半纤维素水解产物）中的木糖资源生产高附加值生物表面活性剂开辟了新途径。所合成的木糖油酸酯混合物展现出优异的乳化性能，为其在工业应用中的替代传统石化来源表面活性剂提供了可能。这项研究为生物催化过程的绿色化和经济性提升做出了重要贡献。