含肉豆蔻样脂肪链的钛茂衍生物通过非DNA作用机制在体内外展现抗 cisplatin 耐药肿瘤活性

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Titanocene-derivative complex modified with a myristic-like aliphatic chain exhibits anticancer activity in vitro and in vivo by cisplatin-alternative mechanisms

本文推荐：为解决钛配合物稳定性差、选择性低等问题，研究人员设计了一种新型钛茂衍生物Myr-Ti，该化合物通过修饰肉豆蔻样脂肪链增强与人血清 albumin (HSA) 亲和力，显著提高在 cisplatin 耐药肿瘤细胞中的摄取和细胞毒性。研究表明 Myr-Ti 通过诱导 G2/M 期阻滞和凋亡发挥抗癌作用，且不引起氧化应激或内质网应激。体内实验显示 Myr-Ti 能显著抑制肿瘤生长且无主要器官毒性，为治疗铂类耐药肿瘤提供了新策略。

　　

在癌症治疗领域，铂类药物如 cisplatin 虽广泛应用，却因其高毒性、缺乏特异性及易产生耐药性而受限。特别是当肿瘤细胞对 cisplatin 产生耐药后，治疗效果大打折扣，亟需开发作用机制新颖的替代药物。钛基配合物曾被视为有潜力的候选者，例如 titanocene dichloride (TiCp₂Cl₂) 和 budotitane 曾进入临床试验，却因在生理环境中易水解、形成聚集体、半衰期短等问题而失败。这些问题导致药物在到达肿瘤前就失活，且缺乏对癌细胞的靶向性。因此，如何提高钛化合物的稳定性、延长其血液循环时间，并增强其对肿瘤细胞的特异性杀伤能力，成为该领域的关键挑战。

在这项发表于《Biomedicine 》的研究中，来自西班牙卡斯蒂利亚-拉曼查大学（Universidad de Castilla-La Mancha）的 Laura Lopez-Sanz、Marta Carmen Guadamillas、Virginia Perez Garrido、Isabel Martinez-Argudo、Sergio Gomez-Lopez、Boiko Cohen、Maria Jose Ruiz、Raul Calero 和 Rosario Serrano 团队，设计并合成了一种新型钛茂衍生物——[TiCp₂{(OOC)₂py-O-Myr}]（简称 Myr-Ti）。该化合物通过引入一个三齿二甲酸配体来增强水解稳定性，并连接一个类似于肉豆蔻酸的脂肪链，使其能与人血清 albumin (HSA) 高亲和力结合。HSA 是血液中最丰富的蛋白质，具有长半衰期，并能被肿瘤细胞大量摄取。利用 HSA 作为药物载体，有望改善钛化合物的递送效率，提高肿瘤靶向性。

为评估 Myr-Ti 的抗癌潜力，研究人员开展了一系列体外和体内实验。关键实验技术包括：细胞培养与细胞活力测定（MTT法）、电感耦合等离子体三重四极杆质谱（ICP-TQ-MS）用于钛含量测定、光谱学分析（UV-Vis）和DNA迁移实验（凝胶电泳）以考察与DNA的相互作用、流式细胞术用于细胞周期和凋亡分析、活性氧（ROS）检测、蛋白质免疫印迹（Western blot）和免疫荧光分析内质网应激及相关通路、以及小鼠异种移植模型（使用A2780CIS cisplatin 耐药人卵巢癌细胞系）进行体内药效和安全性评价。

3.1. 合成与表征

研究人员成功合成了 Myr-Ti，并通过核磁共振（NMR）和高效液相色谱（HPLC）验证了其结构和高纯度（>98%）。该化合物在PBS缓冲液中会自发形成聚集体，但能与人血清 albumin (HSA) 高亲和力结合（K_a ≈ 1 × 10⁶ M^-1），这得益于其肉豆蔻样脂肪链。

3.2. 体外对 cisplatin 耐药细胞的细胞毒性

MTT实验表明，Myr-Ti 对 cisplatin 敏感（A2780, COR-L23）和耐药（A2780CIS, COR-L23CPR）的人卵巢癌和肺癌细胞株均表现出比 titanocene dichloride 更强的细胞毒性，其IC₅₀值在20.5-32.5 μM范围内，而 titanocene dichloride 在测试浓度范围内未达到IC₅₀。重要的是，Myr-Ti 在耐药细胞中的耐药因子（RF: 卵巢癌1.4，肺癌1.6）显著低于 cisplatin（RF: 卵巢癌3.2，肺癌2.7），表明其克服 cisplatin 耐药的能力更强。在非肿瘤细胞系（HEK293, 3T3, CHO）中，Myr-Ti 的毒性低于 cisplatin，提示其可能具有更好的选择性。

3.3. 钛细胞摄取分析

通过ICP-TQ-MS检测发现，用 Myr-Ti 处理的COR-L23细胞内的钛含量显著高于用 titanocene dichloride 处理的细胞，尤其是在处理3小时后。这表明 Myr-Ti 的脂肪链可能增强了其细胞摄取。

3.4. DNA相互作用研究

UV-Vis光谱分析显示，双链DNA（dsDNA）的存在并不影响 Myr-Ti 的自发成核速率，提示两者间无强相互作用。质粒DNA迁移实验进一步证实，即使在高浓度下，Myr-Ti 也不会像 cisplatin 那样引起DNA构象变化（如超螺旋迁移改变）。这些结果强烈表明DNA不是 Myr-Ti 的主要作用靶点。

3.5. 细胞应答

流式细胞术分析显示，Myr-Ti 能显著诱导 cisplatin 敏感和耐药细胞发生早期凋亡（Annexin V+/7AAD-细胞比例增加），并引起G₂/M期细胞周期阻滞，同时G₀/G₁期细胞减少。而 titanocene dichloride 未产生此类效应。此外，Myr-Ti 处理并未导致细胞内活性氧（ROS）水平升高，且抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）不能逆转其细胞毒性，说明其作用不依赖氧化应激。进一步研究排除了内质网应激（未检测到ATF4蛋白上调和XBP1 mRNA剪接）、paraptosis（细胞未肿胀，ERK通路未持续激活）等其它死亡方式。免疫荧光也未发现内质网（PDI标记）或线粒体（MitoTracker标记）的明显形态学改变。

3.6. 溶血试验

Myr-Ti 即使在12 mM高浓度下，对小鼠红细胞的溶血率也低于4%，表现出优异的血液相容性，远优于游离的 cisplatin。

3.7. 体内抗肿瘤活性

在携带A2780CIS（cisplatin 耐药）肿瘤的裸鼠模型中，腹腔注射 Myr-Ti（2.5 mg/kg）可显著抑制肿瘤生长，效果优于 cisplatin，并延长了小鼠的生存期。组织学分析显示，Myr-Ti 治疗组肿瘤出现广泛坏死和纤维化，增殖标志物Ki67阳性区域减少，而对主要器官（肝、肾、心）未造成明显损伤。

本研究证实，通过合理设计将 albumin 结合模块（肉豆蔻样链）引入钛茂骨架，可显著改善钛(IV)配合物 Myr-Ti 的稳定性和肿瘤靶向递送。Myr-Ti 在体外对 cisplatin 耐药肿瘤细胞有效，其机制与 cisplatin 不同，不直接作用于DNA，不引发显著氧化应激或内质网应激，而是通过诱导G₂/M期阻滞和凋亡发挥抗癌作用。更重要的是，体内实验证明了 Myr-Ti 能有效抑制 cisplatin 耐药肿瘤的生长且安全性良好。这些发现为开发基于非DNA靶向机制的金属抗癌药物，特别是用于克服铂类耐药提供了新的思路和强有力的临床前证据，值得进一步深入研究。