综述：利用基因编码荧光指示剂揭示线粒体代谢

这篇综述系统梳理了基因编码荧光指示剂（GEFIs）在实时、原位监测线粒体基质关键代谢物动态方面的最新进展。文章详细介绍了针对单羧酸盐、三羧酸循环中间体、氨基酸、氧化还原辅因子和能量核苷酸等各类代谢物的线粒体靶向GEFIs，阐述了其设计原理（如FRET和单荧光蛋白传感器）、靶向策略（如使用COX8、Su9等线粒体靶向序列）及应用挑战（如校准、pH敏感性和潜在缓冲效应），为在亚细胞分辨率下定量绘制代谢网络提供了重要工具指南。

　　

引言

线粒体远不止是细胞的“动力站”，更是整合生物能量、生物合成和信号功能的动态代谢枢纽。其基质不仅是三羧酸循环（TCA循环）、脂肪酸β-氧化和氨基酸代谢关键分支的场所，还支持血红素合成、尿素循环、钙处理和氧化还原稳态。解析这些相互交织的通路，需要能够在离子梯度和大分子拥挤度得以保留的原位报告代谢物动态的工具。基因编码荧光指示剂（GEFIs）正是这样的工具，它们是蛋白质基础的指示剂，其光谱特性在结合目标代谢物时发生改变。由于其基因编码的特性，这些荧光指示剂可以在特定细胞类型和亚细胞区室中表达，从而实现对活体系统中代谢动态的实时、非侵入性追踪。

线粒体代谢概览

线粒体是碳水化合物、脂肪和蛋白质这三大能量丰富大分子分解代谢的最终目的地。这些途径汇聚于产生乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）和其他关键中间产物，为作为细胞呼吸核心引擎的三羧酸循环（TCA循环）提供燃料。由此产生的还原当量（NADH和FADH₂）将其高能电子提供给电子传递链，驱动ATP的合成。此外，线粒体还是高度特化的代谢途径的关键场所，如尿素循环、酮体生成和血红素合成，这些过程进一步体现了代谢区室化的原则。TCA循环与氧化磷酸化（OXPHOS）的深度互连解释了线粒体疾病中观察到的复杂且严重的表型，这些疾病往往不仅涉及能量缺乏，还包括细胞生长和发育的深刻紊乱。

GEFIs的架构与传感机制

基因编码荧光指示剂（GEFIs）主要有两种基本架构：基于FRET的指示剂和单荧光蛋白指示剂。

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  FRET-based Indicators: 这类指示剂通常包含两个不同的荧光蛋白——供体（如mTFP或Cerulean）和受体（如Venus或Citrine），它们 flank 或整合了传感域。代谢物与配体结合部分的相互作用会诱导构象变化，从而改变供体和受体荧光蛋白之间的距离或取向，进而调节FRET效率。这种变化通常以比率信号（在激发供体时，受体发射与供体发射的比率）来测量。比率输出对传感器浓度、光漂白等因素的敏感性较低，但其动态范围通常较小，结构复杂且庞大，使其难以高效靶向线粒体。尽管如此，仍有成功的案例，如用于监测线粒体ATP的Mit-ATeam和用于监测丙酮酸的Pyronic。
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  单荧光蛋白指示剂: 这类传感器依赖于代谢物结合后单个荧光蛋白荧光强度的变化。常见的策略是使用环状置换荧光蛋白（cpFP），其发色团环境对融合的传感域构象变化更为敏感。单荧光蛋白传感器可以实现较大的动态范围，且遗传构建体尺寸更简单。然而，简单的强度测量读数易受传感器表达水平、光漂白等因素的影响。为了克服这一局限，可以通过利用具有双激发峰的荧光蛋白（如iNap3）、使用等吸收点（如PercevalHR）、共表达第二个惰性荧光蛋白或融合第二个惰性荧光蛋白（如Matryoshka平台）等方式，将强度型指示剂转化为比率型读数。

GEFIs的线粒体靶向

将GEFIs成功靶向线粒体基质是实现其功能的关键。最常用的机制依赖于N端可切割的前导序列，即线粒体靶向序列（MTS）。

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  常用MTS:
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    COX8（细胞色素c氧化酶亚基VIII）: 这是在哺乳动物细胞中将外源蛋白靶向线粒体基质最广泛使用且有效的MTS之一。对于大型或复杂的融合蛋白如许多GEFIs，通常采用串联重复的COX8（如2xCOX8或4xCOX8）来增强导入效率。
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    Su9（F₁F_o-ATP合酶亚基9）: 来自粗糙脉孢菌F₁F_o-ATP合酶N端区域的MTS是另一个成熟且常用的选择，在各种真核系统中也证明是有效的。
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  其他MTS选择: 其他潜在的MTS包括鸟氨酸转氨甲酰酶、超氧化物歧化酶2（MnSOD）和丙酮酸脱氢酶E1α亚基（PDHA1）的引导序列。
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  靶向效率的考量: 成功的线粒体蛋白靶向是一个复杂的过程，不仅取决于MTS的选择。导入效率还受到目标蛋白特性的严重影响。由于前体蛋白必须解折叠才能通过导入通道，一个非常稳定或折叠过快的目标蛋白可能会使转运停滞。此外，MTS的“强度”各不相同，过度使用强效MTS（如COX8A）并在高水平表达时，可能会使导入 machinery 饱和，从而竞争性抑制必需内源蛋白的导入，导致线粒体功能障碍。因此，需要平衡GEFI的表达水平、MTS的效价和串联重复的数量，以实现足够的基质信号，同时避免过度的胞质“泄漏”。

针对特定代谢物的线粒体靶向GEFIs

目前，已有多种GEFIs被成功靶向至线粒体基质，用于监测不同类别的代谢物。

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  单羧酸盐指示剂: 例如乳酸（FiLa-Mit, R-iLACCO1.2）和丙酮酸（PyronicSF）传感器。这些工具揭示了乳酸在线粒体中高度富集，而丙酮酸浓度则维持在较低水平，明确了线粒体丙酮酸载体是代谢的关键调节因子。
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  三羧酸循环代谢物指示剂: 目前仅有少数传感器被成功靶向，如用于乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）的PancACe和用于柠檬酸（Citrate）的Citron1。这凸显了在直接可视化TCA循环这一细胞能量中心方面，我们仍处于早期探索阶段。
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  氨基酸指示剂: 例如靶向线粒体的组氨酸（FHisJ-Mit）和谷氨酰胺（Mito-GlutaR）传感器。使用FHisJ-Mit的研究能够直接量化游离组氨酸，并测量其跨线粒体内膜的转运动力学。
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  辅因子指示剂: 包括用于NAD⁺、NADH、NADPH等的传感器。一个关键的挑战是许多现有GEFIs对这些辅因子的亲和力过高，而线粒体基质中它们的浓度估计在毫摩尔范围，导致传感器饱和，无法准确报告动态变化。这强调了GEFIs的设计必须使其检测范围与特定亚细胞区室中的分析物浓度相匹配。
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  能量核苷酸指示剂: ATP传感器（如mit-ATeam系列、mito-iATPSnFR2）是研究最深入的类别之一。它们被用于揭示线粒体ATP在细胞机械信号转导等过程中的核心作用。此外，还有用于监测ATP/ADP比值（如PercevalHR）和GTP/GDP（如GRISerHR）的传感器。

挑战与考量

尽管线粒体靶向GEFIs前景广阔，但其广泛应用仍面临若干挑战。

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  线粒体环境中的校准: 在原位获得绝对定量浓度仍然是一个重大挑战。常用的方法（如用毛地黄皂苷透化细胞膜）可能会改变线粒体环境。因此，从靶向线粒体的GEFIs获得的校准数据必须谨慎解读。
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  pH敏感性与荧光蛋白伪影: 线粒体基质pH通常比胞质更偏碱性。许多荧光蛋白对pH敏感，如果不加以考虑，pH诱导的荧光变化可能被误解为代谢物浓度的变化。需要仔细表征指示剂在线粒体环境中的行为，或选择已知稳健的荧光蛋白，或使用有助于减轻此类伪影的比率法。
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  高亲和力GEFIs的潜在缓冲效应: 如果GEFI以高亲和力结合其目标代谢物并以高浓度存在，它可能充当该代谢物的缓冲剂或沉淀池，从而扰动其自然动力学。建议使用尽可能低的表达水平，并包括适当的对照（如表达无反应性的“死亡”传感器版本）来评估潜在的非特异性效应。
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  线粒体导入效率与定位: GEFIs通常是大的融合蛋白，可能是线粒体导入 machinery 难以处理的底物。尽管使用了串联MTS，仍可能有一部分GEFI留在胞质或错误定位到其他细胞区室。通过与已建立的线粒体标记物（如MitoTracker染料）进行共定位研究，来严格验证正确的线粒体定位是至关重要的。

前景展望

未来的发展方向包括利用具有不同光谱特性的GEFIs进行代谢物的多重成像，以同时监测多个代谢参数或将其与其他关键参数（如线粒体Ca²⁺、pH、膜电位）的指示剂结合。将线粒体靶向GEFIs的应用从细胞模型扩展到活体组织和整个生物体是另一个重要前沿，这将为了解复杂生理和病理背景下线粒体代谢的调控提供不可或缺的信息。最后，GEFIs与先进成像技术（如光片显微镜、多光子显微镜、荧光寿命成像FLIM）的协同作用，将继续推动活细胞成像的边界，实现对亚细胞分辨率下代谢过程的动态、定量观测。

结论

基因编码荧光指示剂（GEFIs）是揭示线粒体复杂代谢活动的强大工具。通过将其特异性地靶向线粒体，研究人员能够在原生细胞环境中，以高时空分辨率实时监测关键代谢物的动态变化。尽管在传感器优化、定量校准和in vivo应用方面仍存在挑战，但这一领域的持续发展无疑将加速我们对线粒体在健康和疾病中功能的系统级理解，最终为代谢性疾病的诊断和治疗开辟新的途径。