综述：用于氨基酸及其衍生物微生物生物合成的生物传感器研究进展

《Biotechnology Advances》：Advances in biosensors for microbial biosynthesis of amino acids and their derivatives

本综述系统评述了代谢工程中用于氨基酸及其衍生物生产的生物传感器技术，重点分析了基于转录因子（TF）、核糖开关、FRET、cpFP等六类直接生物传感器，以及针对通用代谢前体、途径特异性前体等四类间接生物传感策略的设计原理、优化方法与应用挑战，为开发高效、可持续的氨基酸相关化合物生产体系提供了重要指导。

　　

Abstract

氨基酸及其衍生物在生物技术、制药、农业和工业制造等多个领域发挥着关键作用。开发用于生产氨基酸及其衍生物的菌株的高通量筛选方法，对于挖掘关键酶和筛选高产菌株至关重要。本综述系统评估了在氨基酸或其衍生物生产菌株的代谢工程中应用的六类直接生物传感器，包括基于转录因子、核糖开关、F?rster共振能量转移（FRET）、环状置换荧光蛋白（cpFP）、化合物诱导推定启动子区域和蛋白质翻译元件的生物传感器。批判性分析了它们的操作原理以及合理设计、性能优化和实际应用方面的最新进展。此外，系统分析了四类间接生物传感策略，用于筛选或调控氨基酸或其衍生物生产菌株，这些策略靶向通用代谢前体、途径特异性前体、酶转化下游代谢物或分支途径中的竞争性中间体。随后，比较了现有生物传感器的设计策略、性能优化方法和实际应用挑战，并讨论了适用于代谢工程的生物传感器的关键参数。这项工作将促进目前缺乏生物传感系统的代谢物的生物传感器开发，并推动现有生物传感器的创新。这些发展有望支持氨基酸相关化合物和其他高价值代谢物的高效、可持续生产。

Introduction

氨基酸是维持生命和健康所必需的，是生物体中不可或缺的分子。它们具有重要的生物学和实用价值，被广泛应用于生物学、医学、营养学、农业和工业等领域。1956年，发现谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）能够积累并分泌L-谷氨酸，这为通过微生物发酵大规模生产氨基酸开辟了道路。到2025年，全球氨基酸需求预计将达到301亿美元，2017年至2022年的复合年增长率为5.6%。在随机诱变菌株发展之后，基因工程和序列分析技术的进步极大地促进了具有提高氨基酸生产能力的菌株的合理设计。代谢工程和合成生物学技术的发展使得能够延伸和优化氨基酸代谢途径，从而在许多领域生产高附加值化学品。

在过去的几十年里，代谢物生物传感器已成为代谢工程中最强大的工具之一，这主要归因于它们能够在微生物发酵过程中实时监测代谢物浓度。通过使细胞能够感知并响应细胞内代谢物水平，生物传感器有助于更深入地了解和更精确地调控代谢途径，从而提高目标化合物的产量。此外，它们在群体水平的代谢组学数据和功能相关的亚细胞代谢动力学之间提供了关键联系。许多代谢物可以被活细胞中广泛的天然生物成分（如核糖开关、转录因子或酶）感知，这些成分已被改造和设计成一系列针对特定小分子的生物传感器。这些工程化的生物传感器支持代谢工程中的多种应用，例如菌株的适应性实验室进化（ALE）、遗传部件或优化菌株的高通量筛选（HTS）以及代谢通量的动态控制。它们已成为推进基础研究和生物技术应用不可或缺的工具。

近年来，针对各种氨基酸、其衍生物及其生物合成途径中关键代谢中间体的生物传感器的设计、构建和性能优化投入了大量的研究工作。这些进展显著提高了微生物中氨基酸及其衍生物的生产能力。用于氨基酸或其衍生物生产菌株代谢工程的生物传感器根据其检测底物可分为两类：（1）特异性响应目标氨基酸或衍生物的传感器（即直接生物传感器），（2）响应相关生物合成途径中的代谢物而非氨基酸或衍生物本身的传感器（即间接生物传感器）。用于直接检测氨基酸及其衍生物的传感器主要有六类，包括：基于转录因子（TF）的生物传感器、基于核糖开关的生物传感器、基于F?rster共振能量转移（FRET）的生物传感器、基于环状置换荧光蛋白（cpFP）的生物传感器、基于化合物诱导推定启动子区域的生物传感器以及基于蛋白质翻译元件的生物传感器。此外，还开发了四种间接检测策略，用于动态调控或增强氨基酸及其衍生物的生物合成，包括靶向通用代谢前体、途径特异性前体、酶转化下游代谢物和分支途径中竞争性中间体的策略。

以下部分首先概述应用于氨基酸或其衍生物生产菌株代谢工程的六类主要直接生物传感器的操作原理，重点介绍其合理设计、性能优化和实际应用方面的最新进展。接着，将综述用于筛选生产氨基酸或其衍生物的微生物菌株的四类间接生物传感器的设计、优化和应用方面的最新进展。最后，将评估不同类型现有生物传感器的优势和局限性，并提出战略性设计框架，以指导开发针对目前缺乏高效检测平台的氨基酸种类和衍生物的新型生物传感系统。

Direct biosensors for amino acids and their derivatives

蛋白质氨基酸是由中心碳代谢途径（包括糖酵解（EMP）途径、磷酸戊糖途径（PPP）和三羧酸（TCA）循环）产生的代谢前体生物合成的。氨基酸衍生物生物合成途径的代谢网络如图5至图8所示。本节系统描述了用于氨基酸及其衍生物的六类主要直接生物传感器。

基于转录因子（TF）的生物传感器利用能够特异性结合目标代谢物（配体）的转录调节蛋白。配体结合会诱导TF构象变化，从而影响其与DNA启动子区域的结合亲和力，进而调控下游报告基因（如荧光蛋白基因）的表达。这类传感器具有高特异性和可编程性，是代谢工程中最常用的传感器类型之一。合理设计和定向进化已被用于优化TF传感器的动态范围、灵敏度和正交性。

基于核糖开关的生物传感器是位于mRNA非翻译区（UTR）的顺式作用调节元件，能够直接结合特定代谢物。代谢物结合引起RNA构象变化，从而影响转录终止、翻译起始或mRNA稳定性。核糖开关传感器响应速度快，且无需蛋白质表达，但其动态范围和可移植性有时受限。工程化核糖开关以拓展其识别谱和改善性能是当前的研究热点。

基于F?rster共振能量转移（FRET）的生物传感器通常由一对荧光蛋白（供体和受体）通过对目标代谢物敏感的连接肽连接而成。代谢物结合引起连接肽构象变化，从而改变供体与受体之间的FRET效率。FRET传感器能够实现代谢物的实时、定量、无创成像，具有高时空分辨率，但其构建和校准相对复杂，且体内应用可能受到自发荧光干扰。

基于环状置换荧光蛋白（cpFP）的生物传感器是通过对荧光蛋白进行环状置换改造而成，使其末端对代谢物诱导的构象变化敏感。代谢物结合会导致cpFP的荧光强度或激发/发射光谱发生变化。这类传感器设计相对简单，能够直接将代谢物浓度转化为光学信号，但通常需要针对每种目标代谢物进行特定的蛋白质工程改造。

基于化合物诱导推定启动子区域的生物传感器利用天然或工程化的启动子序列，这些序列能够被特定的代谢物或相关化合物激活或抑制。通过将这类启动子与报告基因连接，可以实现对代谢物浓度的间接监测。这类传感器的开发依赖于对微生物天然调控网络的挖掘和表征。

基于蛋白质翻译元件的生物传感器通过代谢物调控翻译过程来工作。例如，某些代谢物可以影响核糖体结合位点（RBS）的 accessibility 或翻译因子的活性，从而调控报告蛋白的合成速率。这类传感器将代谢物 sensing 与基因表达的直接输出相结合。

Indirect biosensors for amino acids and their derivatives

除了直接响应氨基酸或其衍生物的传感器外，间接生物传感器也能够实现对目标氨基酸或其衍生物代谢通量的动态和精确调控。此类系统通过优化实时代谢通量来增强合成途径的效率，从而强化氨基酸或衍生物的合成。本节将系统描述四种间接生物传感范式，并阐述其设计原理和应用。

第一种策略靶向通用代谢前体，例如中心代谢途径中的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、丙酮酸或乙酰辅酶A。通过监测这些前体的浓度变化，可以间接推断下游氨基酸合成途径的通量状态，并据此进行动态调控。例如，当PEP水平升高时，可以激活分支途径将碳流导向目标氨基酸的合成。

第二种策略关注途径特异性前体，这些前体是特定氨基酸合成途径中的关键中间体。例如，对于芳香族氨基酸，分支酸是一个重要的前体。设计对分支酸敏感的传感器可以用于优化芳香族氨基酸及其衍生物（如L-色氨酸、L-苯丙氨酸）的生产。

第三种策略针对酶转化下游代谢物。例如，目标氨基酸可能被特定的酶进一步转化为其他化合物。通过监测这些下游代谢物的浓度，可以反向推断目标氨基酸的积累情况。这在目标氨基酸本身难以直接检测时尤为有用。

第四种策略聚焦于分支途径中的竞争性中间体。在许多氨基酸合成网络中，存在共享前体的分支途径。通过监测竞争性分支途径中间体的水平，可以动态调整代谢通量，减少副产物的生成，从而将更多的碳流导向目标氨基酸的合成。例如，在L-赖氨酸和L-苏氨酸的合成中，天冬氨酸激酶是一个关键节点，监测竞争性中间体有助于平衡通量。

Challenges in developing biosensors for amino acids and their derivatives

我们之前的分析系统地表征了用于氨基酸及其衍生物的各种生物传感器结构，其中基于TF的系统成为主要的研究焦点。这种优先性反映了原核生物代谢物响应TF的进化多样性。它们的模块化配体结合域和正交功能的DNA识别基序为工程化小分子检测系统提供了强大的适应性。然而，天然调控元件通常存在局限性，如检测范围窄、背景信号高、与其他细胞成分存在串扰等。从头设计或深度工程化TF传感器以克服这些限制是当前面临的重大挑战。对于其他类型的传感器，如核糖开关和FRET传感器，其挑战在于提高稳定性、降低毒性、改善体内性能以及实现多重检测。此外，将传感器有效整合到宿主代谢网络中，并确保其在不同生长条件下可靠工作，也是实际应用中的关键问题。开发通用、模块化的传感器设计平台，以及建立高效的传感器性能表征和优化流程，对于推动该领域的发展至关重要。

Conclusions

不同生物传感器类型在操作机制上固有的多样性赋予了它们在实际应用中独特的优势和局限性。尽管在开发某些氨基酸及其衍生物的传感器方面取得了显著进展，但该类别中的许多化合物仍然缺乏有效的检测平台。本综述系统描述了应用于氨基酸或其衍生物生产菌株代谢工程的生物传感器的分类方案和基本操作机制。通过比较分析现有传感器的设计策略、性能优化方法和应用挑战，为未来开发新型生物传感系统提供了指导框架。重点讨论了适用于代谢工程的生物传感器的关键参数，如灵敏度、特异性、动态范围、响应时间和正交性。这项工作将促进针对目前缺乏生物传感系统的代谢物的传感器开发，并推动现有传感器的创新。这些发展有望支持氨基酸相关化合物和其他高价值代谢物的高效、可持续生产，从而满足工业、医药和农业等领域日益增长的需求。未来的研究方向可能包括利用人工智能辅助设计、开发新型传感机制（如基于CRISPR的传感器）以及实现复杂代谢途径的多路实时监控。