基于DNA自组装的靶标直接荧光编码技术实现10重microRNA同步检测

《Biosensors and Bioelectronics》：DNA Self-Assembly-Based Direct Fluorescence Encoding of Targets Enables Simultaneous 10-plex microRNA Detection

本综述系统阐述了一种集成PGM-MB病毒富集与单管RT-RAA-CRISPR/Cas12a系统的生物传感平台，该平台通过HBGA模拟捕获和衣壳完整性保护实现诺如病毒的高效富集与感染性判别，结合琼脂糖-矿物油屏障技术实现无交叉污染的等温扩增（RT-RAA，37°C，15分钟）与CRISPR/Cas12a检测（20分钟），在60分钟内完成检测，灵敏度达6–8拷贝/反应，显著优于RT-qPCR，为环境病毒监测提供了创新解决方案。

　　

亮点

通过双功能PGM-MB（猪胃黏蛋白磁珠）实现病毒的高效捕获与感染性判别，结合创新单管RT-RAA（逆转录重组酶介导扩增）-CRISPR/Cas12a系统，建立了一种快速、高灵敏度的诺如病毒环境监测平台。

结论

本研究开发的集成生物传感平台成功克服了环境诺如病毒监测的关键技术瓶颈。通过PGM-MB富集技术与单管RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测系统的协同作用，实现了对存活病毒的高效捕获（基于HBGA配体模拟）和衣壳完整性保护，同时利用琼脂糖-矿物油屏障实现了无交叉污染的等温扩增。该平台灵敏度达到6–8拷贝/反应，优于传统RT-qPCR方法，具备100%基因型特异性识别（GI/GII）能力，并展现出强大的抗干扰性能。在302例环境水样（河流、沿海水域、废水）的实地验证中，与RT-qPCR结果完全一致，且揭示了冬季（1–2月、11–12月）为病毒流行高峰、夏季（5–8月）检出率降低的流行病学规律。未经处理的废水病毒检出率最高（GII: 40.9%；GI: 24.8%），凸显其作为诺如病毒传播关键储库的重要性。本系统为环境病毒监测提供了兼具机制创新、高性能及现场适用性的全新策略。

试剂与病毒毒株

采用分子生物学级别高纯度试剂以确保平台性能。病毒RNA提取使用天根生化科技（DP441）试剂盒，CRISPR/Cas12a检测系统采用迈基因（C001M）组件，RT-RAA试剂盒（JY0203）配备特异性设计的5′-FAM-TTTATTT-BHQ-3′报告序列以优化信噪比。

RT-RAA引物的策略性设计与灵敏度优化

通过靶向诺如病毒单链RNA基因组（约7.5 kb）高度保守区域（如ORF1-ORF2连接区及VP1衣壳基因），系统优化引物设计以兼顾扩增效率与CRISPR兼容性（详见表S1）。