基于ADNA启动CRISPR/Cas12a介导RCA循环的超快等温检测技术及其在呼吸道病毒诊断中的应用

《Biosensors and Bioelectronics》：Ultra-fast One-pot Isothermal Detection of Respiratory Virus: ADNA-initiated CRISPR/Cas12a-mediated RCA Cycle

本文报道了一种名为ACRE（ADNA-initiated CRISPR/Cas12a-mediated RCA cycle）的超快速、一锅法等温检测技术。该技术通过计算模拟、核酸工程设计和酶动力学分析，将滚环扩增（RCA）与CRISPR-Cas12a系统创新性结合，实现了对呼吸道病毒RNA的直接检测（无需反转录）。ACRE利用工程化辅助DNA（ADNA）启动反应，通过Cas12a的顺式切割（cis-cleavage）活性与工程化Padlock探针将线性RCA转化为RCA循环，并利用Cas12a的反式切割（trans-cleavage）活性进行信号输出与放大，检测灵敏度达阿摩尔级别（aM），具备单核苷酸特异性，对浓度高于10 pM的靶标可在2.5分钟内完成检测，在分子诊断领域具有重要应用前景。

　　

Section snippets

Materials and methods

材料和方法部分详见补充信息。

Working principle of ACRE

ACRE检测技术的开发始于工程化辅助DNA（ADNA）的设计。ADNA通过其靶标结合臂和Padlock结合臂，分别与靶标RNA和Padlock探针相互作用。样品制备过程中的快速变性和退火步骤增强了这些相互作用（图1A）。图1B概述了ACRE系统的组成部分。随后，我们设计了作为连接滚环扩增（RCA）与CRISPR-Cas12a系统桥梁的工程化Padlock探针。该Padlock是一条5‘磷酸化的单链DNA（ssDNA），包含两个...

Conclusion

在本研究中，我们设计了ADNA和Padlock探针，将CRISPR-Cas12a系统与滚环扩增（RCA）整合，建立了一个用于长链RNA检测的系统。在开发ACRE的过程中，我们利用二级结构预测算法优化了设计参数，包括ADNA结合位点、Padlock结构以及结合臂长度，以确保最佳的检测性能。ACRE具有两个关键反应：（1）利用Cas12a的顺式切割（cis-cleavage）活性和工程化Padlock探针，将线性RCA转化为RCA循环；（2）持续的RCA循环不断驱动Cas12a的反式切割（trans-cleavage）活性，从而实现信号的激活和放大。总之，我们成功开发了一种用于呼吸道病毒检测的一锅法、等温、超快速、高灵敏度且高特异性的诊断方法。

CRediT authorship contribution statement

Lun Luo: 验证，监督，资源。 Bin Hong: 写作-审阅和编辑，监督。 Yixiao Sheng: 写作-审阅和编辑，软件。 Wenhai Wang: 写作-审阅和编辑，方法论。 Junzhuo Shan: 写作-审阅和编辑，写作-初稿，验证，软件，方法论，研究，数据整理，概念化。 Jufang Wang: 写作-审阅和编辑，监督，项目管理，资金获取。 Yi Ma: 监督，项目管理。

Declaration of Competing Interest

?? 作者声明，他们没有已知的、可能影响本研究报告结果的竞争性财务利益或个人关系。

Acknowledgements

本工作得到了广州市科技计划项目（202205110007）的资助。