Orai1通过调控Orai3合成与稳定性及ERα表达在管腔型乳腺癌细胞中调节ERα-Orai3轴的作用与机制研究

《Cell Calcium》：Orai1 plays a critical role in Orai3 synthesis and stability in luminal breast cancer cells

本研究针对管腔型乳腺癌细胞中Orai3依赖性钙池操纵性钙内流(SOCE)的调控机制尚不明确的问题，研究人员通过基因敲除、RNA干扰、钙成像及分子生物学技术，揭示了Orai1并非作为主要SOCE组分，而是通过促进Orai3蛋白合成、抑制其内吞-溶酶体降解途径来维持Orai3稳定性，同时调控雌激素受体α(ERα)表达，从而调控ERα-Orai3轴的新机制。该发现为针对Orai1-ERα-Orai3轴的管腔型乳腺癌靶向治疗策略提供了理论依据。

　　

在乳腺癌，特别是占多数的管腔型亚型中，钙离子(Ca²⁺)信号通路的异常与肿瘤进展和化疗耐药密切相关。钙池操纵性钙内流(SOCE)是细胞外Ca²⁺进入胞内的主要途径之一，由内质网钙库耗竭触发，对于基因转录、细胞增殖和分化等过程至关重要。SOCE的核心组分是位于细胞膜上的Orai通道蛋白家族（包括Orai1, Orai2, Orai3）和位于内质网上的钙感受器STIM蛋白。有趣的是，在管腔型乳腺癌细胞（如MCF-7细胞系）中，SOCE主要依赖于Orai3，而非在大多数细胞中起主导作用的Orai1。Orai3的表达和活性已被证明受雌激素受体α(ERα)的调控，形成ERα-Orai3轴，该轴在管腔型乳腺癌的肿瘤发生中扮演重要角色。然而，Orai1在这一特定背景下的功能，特别是其与Orai3和ERα之间是否存在相互作用以及如何相互作用，尚不清楚。为了解决这些问题，由Alvaro Macias-Diaz、Joel Nieto-Felipe、Juan A. Rosado等人组成的研究团队在《Cell Calcium》上发表了他们的最新研究成果。

研究人员主要应用了CRISPR-Cas9技术构建的Orai1基因敲除(Orai1-KO)MCF-7细胞模型、利用shRNA和siRNA进行的基因敲低技术、蛋白质免疫印迹法(Western Blot)分析蛋白表达、基于fura-2染料的实时荧光比率钙成像技术测定胞质游离钙浓度([Ca²⁺]_i)、荧光素酶报告基因检测分析启动子活性、以及共聚焦显微镜观察转录因子NFAT2的核转位等关键技术方法。

3.1. Orai3表达和SOCE在管腔型乳腺癌MCF-7细胞中需要Orai1

研究人员首先发现，与野生型(WT)MCF-7细胞相比，Orai1-KO MCF-7细胞中Orai3的蛋白水平显著降低，而STIM1和STIM2的表达无显著变化。同时，Orai1缺失导致毒胡萝卜素(TG)诱导的细胞内钙库释放和随后的SOCE均显著减弱。为了排除基因敲除细胞可能存在的补偿性适应，研究团队在WT-MCF-7细胞中利用shOrai1或siOrai1瞬时敲低Orai1，同样观察到了Orai3蛋白水平的下降以及SOCE的减弱。在另一管腔型乳腺癌细胞系T47D中敲低Orai1也得到了类似结果。这些发现表明，Orai1是维持MCF-7和T47D细胞中Orai3充分表达和完整SOCE激活所必需的。

3.2. Orai1通过调节管腔型乳腺癌MCF-7细胞中的Orai3表达间接支持SOCE

为了区分Orai1是直接作为钙内流通道还是通过调节Orai3来影响SOCE，研究人员在Orai1-KO MCF-7细胞中，使用弱启动子（胸苷激酶TK启动子）介导的质粒重新表达Orai1α（全长变体）。转染24小时后，Orai1蛋白得到恢复，但Orai3蛋白水平和SOCE均未发生改变。然而，当将观察时间延长至7天时，Orai1的重新表达成功恢复了Orai3的蛋白含量和SOCE。此外，使用Orai3的特异性激动剂2-APB（50 μM）刺激细胞时，Orai1-KO细胞产生的钙内流响应小于WT细胞，进一步证实了Orai1缺失导致Orai3功能蛋白减少。相反，在Orai1-KO细胞中过表达Orai3能显著增强SOCE，而在WT细胞中敲低Orai3则削弱SOCE。这些结果强有力地表明，Orai1并非MCF-7细胞中SOCE的主要介导者，而是通过维持Orai3的蛋白水平来间接支持SOCE。

3.3. Orai1参与管腔型乳腺癌MCF-7细胞中Orai3的合成并保护Orai3免于降解

接下来，团队深入探讨了Orai1调控Orai3表达的机制。通过荧光素酶报告基因检测发现，Orai1-KO细胞中Orai3启动子的活性显著低于WT细胞，表明Orai1参与调控ORAI3基因的转录。通过使用蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX)处理细胞，他们发现Orai1缺失加速了Orai3蛋白的降解。进一步使用溶酶体抑制剂巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1)和蛋白酶体抑制剂MG132进行处理，结果显示巴弗洛霉素A1能显著提升WT细胞中Orai3的蛋白水平，而MG132无此效果，说明Orai3主要通过内吞-溶酶体途径降解，而Orai1的存在可以减缓这一降解过程。综上所述，Orai1通过促进ORAI3基因转录和抑制Orai3蛋白的溶酶体降解双重机制，来维持Orai3的蛋白稳态。

3.4. Orai1调节管腔型乳腺癌MCF-7细胞中的雌激素受体α表达

鉴于ERα已知可调节Orai3的表达，研究人员检测了Orai1对ERα蛋白水平的影响。结果显示，在Orai1-KO MCF-7细胞、以及Orai1敲低的WT-MCF-7和T47D细胞中，ERα的蛋白表达均显著降低。在Orai1-KO细胞中重新表达Orai1α或Orai1β（另一种Orai1变体）一周后，ERα的蛋白水平得以恢复。这表明Orai1对于维持管腔型乳腺癌细胞中ERα的蛋白表达也至关重要，从而将Orai1与已知的ERα-Orai3轴联系起来。

3.5. NFAT2在Orai1存在下诱导MCF-7细胞中ERα和Orai3表达的减弱

Orai1是激活转录因子NFAT（活化T细胞核因子）所必需的。本研究证实，在MCF-7细胞中，ATP刺激引起的NFAT2核转位依赖于Orai1。有趣的是，在WT-MCF-7细胞中过表达NFAT2，会导致ERα和Orai3的蛋白水平下降，同时Orai1的蛋白水平也降低；然而，在Orai1-KO细胞中，NFAT2过表达则不影响ERα和Orai3的水平。这表明NFAT2对ERα和Orai3的负向调节作用需要Orai1的存在，可能构成一个反馈调节环路。

总结与讨论部分指出，本研究揭示了Orai1在管腔型乳腺癌细胞中的一个新颖功能：它主要不是作为SOCE的成孔亚基，而是作为Orai3和ERα表达的关键调节因子。Orai1通过增强ORAI3基因转录和抑制Orai3蛋白的溶酶体降解来维持Orai3的稳定表达，同时它也维持ERα的蛋白水平，从而共同调控对管腔型乳腺癌至关重要的ERα-Orai3轴。此外，Orai1介导的NFAT2激活可能参与了一个复杂的反馈调节网络。这些发现深化了对Orai通道在癌症中功能复杂性的理解，揭示了Orai1、ERα和Orai3之间存在的精细调控轴。鉴于Orai3和ERα在管腔型乳腺癌进展中的关键作用，靶向Orai1以破坏ERα-Orai3轴，可能为开发该亚型乳腺癌的新型治疗策略提供有前景的思路。