细胞色素P450介导苯并三唑类紫外线稳定剂新型毒性代谢途径的机制导向分析

本研究针对苯并三唑类紫外线稳定剂（BZT-UVs）代谢途径不明、毒性风险认知不足的问题，通过机制导向分析（MDA）策略，首次系统揭示了人细胞色素P450酶介导的五种BZT-UVs（UV-P、UV-PS、UV-328、BZT、UV-329）产生生物活性代谢物的新途径。研究结合密度泛函理论（DFT）预测、人肝微粒体（HLMs）体外实验及质谱技术，鉴定出24种新型代谢物，包括持久性1H-苯并三唑、反应性邻苯醌/环氧化物及具有显著抗雌激素活性的C-C二聚体。其中，UV-P的Cortho–C′ortho二聚体在小鼠体内证实存在，其抗雌激素活性较母体化合物强约60倍，而BZT环氧化物可形成DNA加合物，提示潜在遗传毒性。该研究为BZT-UVs的风险评估提供了必须纳入代谢物谱的新视角，MDA策略为揭示新兴污染物的毒理学相关代谢途径提供了普适性方法。

　　

在工业生产与日常生活中，苯并三唑类紫外线稳定剂（Benzotriazole UV stabilizers, BZT-UVs）被广泛添加于塑料、汽车部件和建筑材料中，用以抵御紫外线辐射造成的降解。随着全球需求的增长，这类化学品的产量和应用范围持续扩大，其全球市场规模在2022年已达到13亿美元，并预计在2028年增长至18亿美元。然而，作为备受关注的新兴污染物，BZT-UVs表现出环境持久性、远距离迁移潜力、生物累积性以及普遍的人类暴露。它们还具有潜在的健康风险，包括内分泌干扰、生殖发育毒性和免疫毒性。因此，欧盟等监管机构已将某些BZT-UVs列为高度关注物质（SVHC），UV-328更是被列入《斯德哥尔摩公约》持久性有机污染物（POPs）清单。

尽管BZT-UVs在人体和动物体内被日益频繁地检出，但现有研究大多聚焦于母体化合物本身。对于这些化合物进入生物体后，会被如何代谢转化？会产生哪些新的代谢产物？这些代谢产物是否具有不同于母体化合物的毒性？这些问题目前尚不清晰。这一认知缺口至关重要，因为代谢物可能表现出与母体截然不同的毒性和环境行为。以往关于BZT-UVs代谢的研究，主要集中于细胞色素P450（P450）酶介导的烷基侧链羟基化这一初级氧化途径，这很可能忽略了以其酚-苯并三唑核心结构为中心的、更为复杂的生物活化途径。类似结构的酚类污染物（如三氯生、双酚A）的研究已揭示，P450能介导氧化二聚化或分解等非传统代谢反应，产生生物活性显著增强的内分泌干扰物。鉴于BZT-UVs独特的酚-苯并三唑杂化结构，研究人员推测，其P450介导的代谢过程可能同样存在此前未被识别的反应路径，例如源于酚基团的氧化分解或耦合反应。这些非经典的代谢转化可能产生具有更高毒理学潜力的生物活性代谢物，是当前BZT-UVs环境风险评估范式中的关键知识盲区。

为了解决这一难题，一项发表在《Environment International》上的研究，创新性地采用了“机制导向分析”（Mechanism-Directed Analysis, MDA）策略。该策略旨在通过计算化学预测基于推断机理的未知代谢物结构，进而指导有针对性地分析BZT-UVs那些“未被发现的”代谢途径。研究人员选取了五种在环境中高度使用且普遍存在的BZT-UVs（UV-P、UV-PS、UV-328、BZT、UV-329）作为模型底物，以建立结构-代谢-活性关系。

为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，利用密度泛函理论（Density Functional Theory, DFT）计算，模拟P450活性中心化合物I（Cpd I）与BZT-UVs的反应，预测可能的代谢机制和产物。其次，使用人肝微粒体（Human Liver Microsomes, HLMs）进行体外代谢孵育实验，模拟人体肝脏的代谢过程。第三，采用高分辨液质联用（LC/Q-TOF-MS）、串联质谱（LC-MS/MS）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）等技术，对体外和体内（小鼠模型）样品中的预测代谢物进行定性和定量分析。此外，还利用分子对接技术模拟BZT-UVs与不同P450同工酶的结合模式，并采用酵母双杂交系统评估关键代谢物的抗雌激素活性。

3.1. DFT预测P450酶介导的UV-P新兴代谢谱

理论计算首先聚焦于空间位阻较小的UV-P。研究发现，其酚基团是P450攻击的主要位点，初始的(O)H-提取反应能垒极低，远优于芳香环O-加成或对位甲基(C)H-提取途径。反应生成的关键中间体是UV-P酚氧自由基（UV-P•）和质子化的化合物II（Cpd II）。该自由基的未配对电子自旋密度主要分布在酚环的ipso-C2、ipso-C4和ortho-C6位点，预示着后续反应的多重可能性。计算表明，UV-P•既可以与Cpd II发生“反弹”反应，在C2、C4或C6位形成加合物（奎诺产物），也可能从酶活性中心解离，进入“非反弹”途径。反弹过程是整个反应的决速步骤，这为自由基的解离和后续反应提供了足够的时间窗口。

对于反弹途径，研究重点分析了生成的奎诺产物的进一步演变。计算发现，在C2位形成的奎诺产物（P_reb-C2）可通过分子内质子转移，发生I型ipso-分解，生成1H-苯并三唑（或其阴离子）和邻苯醌，该过程热力学上非常有利。而在C4位形成的奎诺产物（P_reb-C4）若进行II型ipso-分解（释放甲基阳离子），则是一个高度吸能的过程，因此该产物相对稳定。对于非反弹途径，解离出来的UV-P•可以进入第二个反应循环，促使另一个UV-P分子也生成酚氧自由基，进而发生自由基-自由基耦合。计算显示，UV-P•的自旋密度主要分布在酚氧原子（O）和邻位碳原子（C6）上。热力学分析强烈支持C6–C6′位点耦合形成C-C二聚体（UV-P-C_ortho–C′_ortho-UV-P），其自由能远低于C6–O耦合产物，表明C-C二聚是优势路径。

3.2. BZT-UVs的结构-代谢关系

为了系统评估BZT-UVs的代谢路径并建立普适性的结构-代谢-活性关系，研究人员将研究拓展至UV-PS、UV-328、UV-329和BZT。计算结果表明，所有这四种BZT-UVs的初始(O)H-提取过程都与UV-P类似，能垒低，反应放热。随后的反弹步骤同样是决速步，生成的奎诺产物为后续分解提供了可能。

在分解路径方面，所有BZT-UVs的C2位奎诺产物都能发生显著放热的I型ipso-分解，产生共通的代谢物：1H-苯并三唑（阴离子）和对应的邻苯醌类化合物。然而，II型ipso-分解的可行性则取决于对位烷基取代基的性质。对于UV-329、UV-328和UV-PS，其分解生成碳正离子和氢醌的过程在热力学上极其有利，释放的碳正离子（如叔丁基碳正离子）在水中可迅速水合生成单醇。相反，UV-P和BZT（对位为甲基）的II型分解则因甲基碳正离子极不稳定而难以发生。

在耦合路径方面，对于没有邻位取代基的UV-329和UV-PS，其酚氧自由基的自旋密度同样集中在酚氧原子和邻位碳原子。计算证实，C_ortho–C′_ortho耦合形成的二聚体在所有可能的耦合产物中能量最低，是最稳定的形式，这与UV-P的规律一致。

此外，对于含有烯烃结构的BZT，计算还预测了一条与毒性相关的环氧化途径。该途径通过一步环氧化反应直接生成BZT环氧化物，反应能垒适中且高度放热，表明BZT具有较高的环氧化倾向，这可能与其反应性毒性相关。

3.3. 人肝微粒体中BZT-UVs新兴代谢物的检测

为了验证理论预测，研究团队利用LC/Q-TOF-MS、LC-MS/MS和GC-MS等技术，对五种BZT-UVs在HLMs中孵育后产生的代谢物进行了检测。结果成功鉴定出18种新型代谢物，高度支持了DFT预测的代谢机制。

I型ipso-分解途径的代谢物得到确认：在所有五种BZT-UVs的孵育样品中均检测到了1H-苯并三唑（通过标准品比对确认）以及五种不同的邻苯醌型化合物（通过高分辨质谱和碎片离子鉴定，置信度等级为2b）。值得注意的是，1H-苯并三唑本身是一种在多种水环境中被频繁检出的新兴污染物，具有高持久性和高迁移性，其生成增加了BZT-UVs的潜在环境风险。

II型ipso-分解/加成途径的代谢物也部分得到验证：在UV-329和UV-PS的样品中检测到了相应的氢醌类代谢物。对于UV-329，还通过GC-MS分析确认了其II型分解的另一产物——2,4,4-三甲基-2-戊醇的生成。尽管DFT预测UV-328也可发生II型分解，但实验中未检测到相应产物，可能与其实验条件下的分解效率较低有关。此外，在UV-P样品中鉴定到了其C4位ipso-加成代谢物。

耦合途径的代谢物被成功捕获：UV-P、UV-PS和UV-329的C_ortho–C′_ortho耦合二聚体均在HLMs样品中被初步鉴定（置信度等级2b）。这些二聚体通过其精确分子量以及特征性的MS/MS碎片谱图得以识别，例如UV-P二聚体（UV-P-C_ortho–C′_ortho-UV-P）会依次丢失苯并三唑-CH₃-OH等碎片，证实了其结构。

环氧化途径的验证则更具挑战性。虽然在高分辨质谱中观察到一个分子量与BZT环氧化物相符的离子，但其碎片离子表明该物质实为BZT酮，而非预期的环氧化物。鉴于环氧化物通常不稳定且具有亲电反应性，研究人员采用小牛胸腺DNA作为亲核捕获剂来捕捉瞬态的环氧化物中间体。结果在含有DNA的孵育体系中，成功鉴定到了BZT环氧化物与脱氧胞苷（dC）和脱氧胸苷（dT）形成的两种DNA加合物，这为BZT环氧化物作为反应性代谢物的生成及其潜在的基因毒性机制提供了直接证据。

3.4. UV-P耦合代谢物的体内检测及毒性评价

鉴于新发现的代谢物可能具有生物累积性，研究人员首先利用软件预测了它们的辛醇-水分配系数（log K_ow）。结果显示，所有耦合代谢物的log K_ow值均非常高（>4.5），提示存在显著的生物累积风险。例如，UV-P二聚体的log K_ow为5.8，远高于其母体UV-P（4.3）。

为了验证其在真实生物体内的形成，研究团队进行了小鼠体内代谢实验。通过给小鼠灌胃UV-P，并在三天后取其肝脏组织进行分析。利用定制合成的UV-P-C_ortho–C′_ortho-UV-P标准品进行比对，通过LC-MS/MS和高分辨LC/Q-TOF-MS分析，确凿地在小鼠肝脏中检测到了该二聚体代谢物，其保留时间和质谱碎片与标准品完全一致，证实了该代谢途径在活体动物体内的生理相关性。

更重要的是，毒性评价揭示了该二聚体代谢物的显著生物活性。利用酵母双杂交人雌激素受体α（ERα）报告基因实验进行评估，发现UV-P-C_ortho–C′_ortho-UV-P本身并不激活ERα（无激动活性），但在存在低浓度雌二醇（E2, 1 nM）的情况下，表现出强烈的抗雌激素活性（拮抗活性）。在1 μM的浓度下，其对E2诱导的ERα活性的抑制率就达到了71.2%。相比之下，要达到相近的抑制效果（71.03%），需要高达62.5 μM的母体UV-P。这意味着该二聚体代谢物的抗雌激素效力比其母体化合物强了约60倍。结合其显著增强的疏水性（更高的log K_ow），该代谢物的生物累积潜力和内分泌干扰效应引起了高度关注。

3.5. 阐释BZT-UVs代谢谱的基本因素

研究最后从结构基础和反应活性两个层面，深入阐释了支配BZT-UVs新型代谢途径的基本因素。

在结构基础方面，分子对接模拟显示，在所测试的七种肝脏CYP同工酶中，CYP2C19虽然结合能不是最强，但其活性中心的血红素铁与所有五种BZT-UVs的酚氧原子之间的距离均小于6 ?，符合P450催化的“6 ?规则”，表明CYP2C19可能是介导BZT-UVs酚基初始活化关键步骤的最相关同工酶。

在反应活性方面，研究从物理有机化学角度对分解和耦合途径的机理差异进行了理性化阐释。I型ipso-分解的驱动力部分源于苯并三唑环中NH基团的弱酸性（pKa ≈ 8.2），使其在水相中易于质子转移。II型ipso-分解与ipso-加成的关键区别在于生成的碳正离子的稳定性，这可以通过氢负离子亲和能（Hydride Ion Affinity, HIA）来量化。计算发现，II型分解的反应自由能与所生成碳正离子的HIA值高度相关（R2 = 0.99），HIA越低（碳正离子越稳定），分解反应越容易进行。例如，叔丁基碳正离子的HIA远低于甲基碳正离子，因此UV-PS、UV-329等更容易发生II型分解。对于耦合途径，研究发现BZT-UVs酚氧自由基的自旋密度高度离域（61.5%–63.8%），这降低了其电子给予能力，从而提高了反弹能垒。自由基的单占据分子轨道（SOMO）能量与反弹能垒呈显著的负相关关系，SOMO能量越低（电子给予能力越弱），反弹能垒越高，自由基越容易解离并参与耦合反应。

该研究通过机制导向分析（MDA）策略，成功揭示了细胞色素P450酶介导的苯并三唑类紫外线稳定剂（BZT-UVs）的一系列此前未知的、具有毒理学意义的代谢途径。研究不仅通过计算预测，更通过体外和体内实验证实了这些途径的存在，并评估了关键代谢物的生物活性。研究发现，BZT-UVs的代谢存在两条主要的、效应相反的路径：一是氧化均相耦合途径，产生的C-C二聚体（如UV-P二聚体）表现出比母体强数十倍的抗雌激素活性，且具有更高的生物累积潜力；二是分解途径，其通过双模式机制运作，I型分解产生持久且可迁移的污染物1H-苯并三唑和反应性的邻苯醌，II型分解则生成氢醌和可水合为单醇的碳正离子。此外，对于含烯烃的BZT，还证实了其可生成能形成DNA加合物的环氧化物，提示遗传毒性风险。

这项研究的重要意义在于，它将计算化学、体外代谢模型、体内验证和毒性评价有机结合，构建了一个强大的分析框架（MDA），用于系统性发掘新兴污染物的“隐性”代谢命运。研究结果明确警示，仅关注母体化合物的传统风险评估范式存在严重不足，必须将代谢物谱，特别是那些具有更高毒性或持久性的代谢物，纳入对BZT-UVs以及其他结构类似污染物的全面风险评估中。该工作所倡导的MDA策略，为解决新兴污染物代谢转化研究中的“未知的未知”挑战提供了普适性且强有力的工具，有望推动环境毒理学和风险评估向更精准、更前瞻的方向发展。