地热来源新型嗜热PETase（DIEGO）的酶促降解PET研究及其在可持续塑料回收中的应用

《Environmental and Sustainability Indicators》：Enzymatic Degradation of PET Using a Novel Thermophilic PETase

本研究针对一次性塑料PET环境污染问题，从地热宏基因组样本中鉴定出一种新型嗜热PET水解酶DIEGO。该酶在60°C下与温度协同作用，可在4天内将PET完全降解为单体TPA和EG，无需额外添加中间体水解酶，为工业级酶法塑料回收提供了高效候选方案。

　　

随着全球塑料消费量的指数级增长，聚乙烯对苯二甲酸酯（PET）制成的一次性塑料制品已成为最严峻的环境挑战之一。PET作为一种由酯键连接对苯二甲酸（TPA）和乙二醇（EG）的聚合物，每年产量超过2730万公吨，在自然环境中半衰期超过2500年。目前，约60%的PET废弃物被填埋，24%被焚烧，仅15%得到有效回收。这种“持久性”与“短生命周期”的矛盾，促使科学家寻找可持续的解决方案。

2016年，学者在海洋细菌Piscinibacter sakaiensis（原名Ideonella sakaiensis）中发现了首个PET水解酶（PETase），它能将PET分解为TPA、单(2-羟乙基)-TPA（MHET）和双(2-羟乙基)-TPA（BHET），其伴生的MHETase可进一步将MHET转化为TPA和EG。此后，多种PET水解酶（PHEs）被陆续发现，但其中仅不到10%具有热稳定性（耐受65–85°C）。这一温度范围恰与PET的玻璃化转变温度（T_g）重叠。当温度接近T_g时，PET链运动性增强，更易被酶攻击；但温度过高（如70°C）又可能引发PET再结晶，反而阻碍降解。因此，开发兼具高热稳定性和高活性的PETase，是实现工业化酶法回收的关键。

在此背景下，意大利那不勒斯费德里科二世大学的研究团队在《Environmental and Sustainability Indicators》发表论文，报道了一种从地热环境宏基因组中鉴定出的新型嗜热PETase——DIEGO（地热来源解聚孤立酶）。该酶不仅能在60°C下高效降解PET，还可通过与温度协同作用，实现中间体的自水解，从而在4天内将消费后PET（PcPET）完全转化为TPA和EG，绕过了对额外MHETase的依赖。

关键技术方法

研究团队通过隐马尔可夫模型（HMM）从地热宏基因组数据中筛选出DIEGO编码序列，利用AlphaFold3预测其三维结构，并通过SignalP 5.0预测信号肽。将去信号肽的基因密码子优化后克隆至pET21b(+)载体，在E. coliBL21(DE3)中表达并纯化。酶学性质通过酚红（PSP）法、对硝基苯丁酸酯（pNP-butyrate）水解实验、差示扫描荧光法（DSF）等进行表征。PET降解实验采用高效液相色谱（HPLC）监测产物，并通过扫描电镜（SEM）观察材料形态变化。

研究结果

3.1. 序列与结构特征

DIEGO与已知热稳定PETaseLCC（叶堆肥角质酶）序列一致性达85%，但存在44个残基差异，其中24个为非保守替换。关键差异位于催化亚位点（-1和-2）附近：如DIEGO的G65、S98、S99、D120、I122分别对应LCC的R65、D98、A99、N120、N122，这些改变可能影响底物结合。结构预测显示DIEGO与LCC重叠度高（RMSD 0.808 ?），但DIEGO缺乏LCC中用于结合Ca2?的D238位点（变为N238），这可能影响其热稳定机制。

3.2. 酶学性质

DIEGO最适pH为7.5（范围6.0–8.0），最适温度70°C，但70°C下活性半衰期仅15分钟。在60°C和50°C下，酶活性可维持24小时（半衰期约24小时）。其结构熔解温度（T_m）达83°C，加入Ca2?后升至87°C，提示存在其他金属结合位点。动力学参数显示，DIEGO对pNP-butyrate的k_cat/K_M为9600 s^?1 mM^?1，比LCC高6倍。有机溶剂（1%–10%）对其活性无显著影响。

3.3. 底物降解特性

DIEGO可高效水解BHET和纳米PET（nanoPET）。在60°C下，BHET在8小时内完全转化为MHET和TPA；nanoPET被降解为MHET和TPA，但未检测到BHET积累，说明其被快速转化。温度实验表明，MHET仅靠热自水解（k=0.035 h^?1），而BHET同时受酶促（k=0.83 h^?1）和热解（k=0.14 h^?1）驱动。

3.4. 实际PET废弃物降解

未经预处理的PcPET餐盘碎片（8 mg/片）在60°C、DIEGO添加量≥5 μg/mg_PET条件下，96小时内完全降解（失重率≈100%）。HPLC显示，24小时即生成MHET和TPA；96小时后TPA成为主要产物（浓度6.86 mM），MHET因热解而减少。SEM图像证实，酶处理组表面出现侵蚀孔洞，而对照组仅见轻微裂纹。DIEGO对PcPET的降解效率（16.7 mg_PET h^?1 mg_enzyme^?1）与野生型LCC相当，但后者在相同条件下对未预处理PcPET的降解率仅31%。

结论与意义

本研究首次报道了地热来源的嗜热PETaseDIEGO，其通过“酶-热协同”机制，在中等温度（60°C）下实现PET完全降解，避免了高温导致的再结晶问题，且无需添加MHETase。与需预处理的高效突变体（如LCC-ICCG、TurboPETase）相比，DIEGO对原始PcPET的高效降解更具工业应用潜力。该成果为开发低能耗、一步法塑料生物循环技术提供了新策略，有望推动可持续塑料废物管理体系的建立。