法医实验室全基因组测序工作流程的开发验证及其在法医遗传谱系分析中的应用

《Forensic Science International: Genetics》：Developmental Validation of a Whole Genome Sequencing Workflow for Use in a Forensic Laboratory

本文报道了针对法医实验室应用的全基因组测序（WGS）工作流程（涵盖KAPA HyperPrep建库、NovaSeq 6000测序及Tapir生物信息学分析）的开发验证研究。研究证实该流程具有高灵敏度（可检测低至50皮克DNA）、良好的重复性与再现性、低污染风险，并能有效处理混合样本和模拟案件样本，为法医遗传谱系（FGG）分析提供了强大工具，将推动WGS在法医实验室的标准化应用。

　　

结果与讨论 (Results and Discussion)

全基因组测序（WGS）工作流程利用片段化的DNA进行一系列文库构建步骤，包括末端修复、A尾添加、接头连接以及一个可选的扩增步骤，之后将完成的文库加载到高通量测序仪上进行测序并生成原始数据文件。用于WGS分析的生物信息学工具随后将这些原始数据文件通过一系列质量控制（QC）、比对、变异识别（variant calling）、基因型插补（imputation）和混合物检测步骤进行处理。本文展示了一系列验证研究的结果，这些研究旨在评估该工作流程在法医遗传谱系（FGG）背景下的表现。

无模板对照 (No-template controls)

阴性或无模板对照（NTCs）在法医检测中用于评估PCR过程中的污染水平。法医操作程序通常允许在NTC中检测到一定水平的信号，而无需对与该NTC相关的法医样本进行重新扩增。为了确定常规实验室操作中预期的基线信号量，从NTC样本制备了十二个文库（其中一个文库在有和没有全基因组富集（WGE）的情况下进行了测序，以评估富集步骤对背景的影响）。在NTC中检测到的reads数量通常很低（中位数<1000 reads），并且与输入DNA量呈正相关。在NTC中观察到的等位基因数量也很少（中位数<10个等位基因）。这些观察结果与实验室中其他基于测序的检测方法中NTC的表现一致。

生物信息学阴性评估 (Bioinformatic Negatives Assessment)

在假定为无模板的样本（例如，阴性对照）中检测到的低水平信号，或许很容易定义或描述，因为预期结果为零reads。因此，任何观察结果都可以以预定义且可重复的方式处理。然而，当使用预定义的样本表（即，在用于下游处理的样本表中仅包含样本池中的索引）时，运行间的残留污染或来自实验室环境的非目标索引污染可能难以检测。为了评估这种潜在的污染，我们检查了所有测序运行中所有可能索引对（在所有可能的双端索引组合中）的reads计数。对于每次测序运行，我们确定了与样本池中使用的索引不匹配的索引对。这些“生物信息学阴性”索引对中的reads计数被用作运行中索引跳跃（index hopping）或污染的衡量标准。在所有测序运行中，这些“生物信息学阴性”索引对的中位数reads计数都很低（中位数<100 reads），这表明索引跳跃或污染的水平很低，并且与实验室中其他基于测序的检测方法中观察到的水平一致。

结论 (Conclusions)

本文的研究描述了KAPA HyperPrep、NovaSeq 6000测序系统和Tapir工作流程的开发验证。对该工作流程的灵敏度、可重复性、再现性、可靠性、污染可能性、混合物检测和性能以及模拟案件样本的测序能力进行了评估，以支持该工作流程在法医实验室中的实施。

文库扩增步骤经过优化，能够分析低于制造商推荐量的DNA输入量（低至50皮克），同时保持较高的基因分型准确性和覆盖率。文库稳定性研究表明，在-20°C下储存长达六个月后，文库产量和质量没有显著下降。由不同操作员进行的重现性研究证明了该工作流程在实验室环境中的稳健性。阴性对照和生物信息学阴性评估表明，污染水平很低，并且与其他基于测序的法医检测方法中观察到的水平一致。对混合比例从1:1到1:49不等的混合样本进行的测序表明，即使在次要贡献者比例很低的情况下，也能检测到次要贡献者。最后，对模拟案件样本的测序证明了该工作流程处理法医实验室常规遇到的样本类型（即具有相似数量和质量）的能力。