GPX4同源基因通过调控O-GlcNAc-DDR通路在衰老和氧化应激条件下维持肠道干细胞稳态

《Free Radical Biology and Medicine》：GPX4 Ortholog Regulates the O-GlcNAc–DDR pathway to Preserve Intestinal Stem Cell Homeostasis during Aging and Oxidative Stress

本研究针对衰老和氧化应激导致的肠道干细胞稳态失衡问题，通过探讨GPX4同源基因Gpxl与O-GlcNAc修饰的相互作用机制，发现Gpxl通过耦合营养感知O-GlcNAc化与DNA损伤应答，在果蝇和小鼠模型中均能有效维持肠道干细胞功能，为年龄相关性肠道功能障碍和肿瘤进展提供了新的治疗靶点。

　　

随着年龄增长，人体组织器官功能逐渐衰退，其中肠道作为重要的消化吸收和免疫屏障器官，其功能的维持尤为关键。肠道干细胞（Intestinal Stem Cells, ISCs）是肠道上皮细胞更新的源泉，负责持续修复因感染、毒素或衰老而受损的肠道细胞。然而，干细胞本身对氧化和代谢压力高度敏感，在衰老或外界压力下，其稳态容易失衡，导致过度增殖或功能衰退，进而引发年龄相关性肠道功能障碍甚至肿瘤发生。因此，探索在衰老和压力条件下维持肠道干细胞稳态的分子机制，已成为抗衰老研究和肿瘤预防领域的重要课题。

在这一背景下，活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）的积累和细胞内的营养感知信号被认为是调控干细胞行为的关键因素。其中，谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione Peroxidase 4, GPX4）作为一种重要的抗氧化酶，能够特异性还原膜脂质过氧化物，保护细胞膜结构，其功能缺失会触发一种铁依赖性的程序性细胞死亡——铁死亡（ferroptosis）。另一方面，蛋白质O-连接N-乙酰葡糖胺（O-linked β-D-N-acetylglucosamine, O-GlcNAc）修饰是一种动态、可逆的蛋白质翻译后修饰，它作为细胞内的营养传感器，其水平受核苷酸糖UDP-GlcNAc的供应影响，广泛参与调控细胞信号转导、代谢、发育和衰老等过程。先前的研究表明，O-GlcNAc修饰是果蝇肠道干细胞和祖细胞稳态的关键调节因子。然而，GPX4在肠道干细胞中的具体功能，以及其与营养敏感的O-GlcNAc信号之间是否存在相互作用，从而共同协调干细胞命运决定和组织完整性，此前尚不清晰。

为了回答这些问题，由Hyun-Jin Na、YiSeul Kim、Jong Min Kim和Mi Jeong Sung组成的研究团队在《Free Radical Biology and Medicine》上发表了他们的最新研究成果。研究人员利用果蝇肠道这一经典模型系统，并结合小鼠实验，深入探究了GPX4的同源基因Gpxl如何通过调控O-GlcNAc-DDR通路，在衰老和氧化应激条件下维持肠道干细胞稳态。

本研究主要采用了以下关键技术方法：利用果蝇Gal4/UAS系统进行ISCs/EBs（肠道干细胞/成肠细胞）或肠上皮细胞（Enterocytes, ECs）特异性的基因敲低（如Gpxl^RNAi、OGA^RNAi、OGT^RNAi）；通过免疫荧光染色和Western blotting分析目标蛋白（如GPX4、O-GlcNAc、磷酸化组蛋白H3（PH3）、Cleaved Caspase-3等）的表达和定位；使用DHE（二氢乙啶）染色检测活性氧（ROS）水平；采用Oil Red O染色评估脂质积累；通过mRNA测序（RNA-seq）进行转录组分析，筛选差异表达基因并进行基因本体（GO）富集分析；使用老龄（24月龄）C57BL/6小鼠作为衰老模型，分析其小肠组织的病理变化和分子标记物表达。

3.1. 衰老和应激条件下果蝇中肠ISCs/EBs中GPX4的表达

研究人员首先发现，在45日龄的衰老果蝇中肠以及过氧化氢酶（Catalase）突变体（Catⁿ¹，一种内源性氧化应激模型）的中肠中，GPX4的表达均显著上调。利用esg-Gal4, tub-Gal80^ts, UAS-GFP系统（esg^ts>）特异性标记并诱导ISCs/EBs的基因操作，他们进一步证实，在衰老、百草枯（PQ，诱导外源性氧化应激）处理、Catⁿ¹突变、铁死亡抑制剂Ferrostatin-1处理以及OGA抑制剂Thiamet G（可诱导O-GlcNAc升高和发育异常）处理条件下，esg-GFP阳性细胞数量和有丝分裂标记PH3阳性细胞数量均显著增加，同时GPX4的表达也相应升高。更重要的是，共免疫染色显示，在O-GlcNAc水平升高的细胞中，GPX4的表达也同步增强，提示GPX4的表达与ISC增殖以及O-GlcNAc信号之间存在潜在关联。

3.2. 衰老小鼠小肠中的GPX4表达

为了验证果蝇研究结果在哺乳动物中的保守性，研究人员比较了年轻（2月龄）和年老（24月龄）小鼠的小肠组织。H&E染色显示，年老小鼠的小肠隐窝高度和宽度均增加，表明存在与年龄相关的组织结构改变。免疫荧光和Western blotting分析进一步揭示，在年老小鼠增厚的小肠组织中，GPX4、O-GlcNAc、O-GlcNAc转移酶（O-GlcNAc transferase, OGT）、增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA）以及ATM/ATR信号通路的标志物表达均有所上调，特别是在隐窝增厚的区域。这些结果说明，GPX4的上调是跨物种存在的衰老相关现象，并与营养感知信号和DNA损伤应答的激活相伴发生。

3.3. Gpxl和OGT敲低对果蝇ISCs/EBs的影响

为了探究Gpxl与O-GlcNAc之间的关系，研究人员在ISCs/EBs中分别敲低了Gpxl、OGA（O-GlcNAc水解酶，敲低导致O-GlcNAc水平升高）和OGT（O-GlcNAc转移酶，敲低导致O-GlcNAc水平降低）。结果显示，OGA敲低（esg^ts>OGA^RNAi）确实引起了ISCs的过度增殖，而Gpxl敲低（esg^ts>Gpxl^RNAi）和OGT敲低（esg^ts>OGT^RNAi）则未引起显著的增殖变化。在Gpxl和OGT敲低的肠道中，GPX4、O-GlcNAc和ROS水平有下降趋势，但未达到统计学显著性。相比之下，OGA敲低则伴随着ROS水平的升高。这些结果表明，在基础状态下，Gpxl敲低的效果与OGT敲低类似，均未引发显著的增殖表型。

为了从机制上深入理解Gpxl的功能，研究人员对Gpxl敲低的果蝇中肠进行了转录组测序分析。结果显示，共有107个基因表达发生显著改变，其中57个上调，50个下调。基因本体富集分析表明，上调基因主要富集在RNA剪接、脂肪酸代谢和细胞迁移等过程；而下调基因则显著富集于氧化应激反应、热休克蛋白和雌激素受体信号通路等。具体而言，多个抗氧化防御因子（如SOD1、SOD3、CcS）、与线粒体功能相关的基因（如MsrA、BNIP3、AOX1、Sirt2）表达下调，提示Gpxl缺失可能导致抗氧化能力和线粒体功能受损。在DNA损伤应答（DDR）通路中，损伤识别与修复基因（如chk1、Xpc）下调，而双链断裂反应基因（如lok、rad50）上调，表明DDR信号通路失衡。此外，一些调控ISC行为的基因（如Delta、cdc42）表达降低，而细胞周期驱动基因（如cdk2、e2f1）表达增加。这些转录组特征共同说明，Gpxl通过调节氧化还原应答基因网络和应激适应通路来维持肠道稳态。

3.4. Gpxl敲低挽救OGA敲低诱导的发育异常

为了确定Gpxl和O-GlcNAc在ISCs/EBs中的功能关联，研究人员构建了双敲低品系（esg^ts>Gpxl^RNAi + OGA^RNAi）。令人惊讶的是，双敲低成功地挽救了OGA单敲低所导致的ISCs过度增殖。在分子水平上，OGA单敲低引起的GPX4和O-GlcNAc水平升高，在双敲低条件下被显著抑制。此外，双敲低也显著降低了OGA敲低引起的DDR标志物pS/Tq（磷酸化ATM/ATR底物）信号、ROS水平以及脂质积累（通过Oil Red O染色评估）。这些结果强有力地表明，OGA位于Gpxl的上游，而Gpxl是OGA敲低诱导的过度增殖、DDR激活、ROS产生和脂质积累所必需的。换言之，Gpxl通过介导O-GlcNAc的调控作用，影响了下游的氧化应激和基因组稳定性应答。

3.5. Gpxl是氧化应激诱导增殖所必需的

鉴于GPX4在氧化应激下表达升高，研究人员探讨了Gpxl是否参与应激诱导的O-GlcNAc表达和ISC增殖。他们在Gpxl敲低（esg^ts>Gpxl^RNAi）的果蝇中施加PQ处理。结果显示，与仅用PQ处理的对照组相比，Gpxl敲低显著抑制了PQ诱导的esg-GFP阳性和PH3阳性细胞数量的增加。更重要的是，即使在PQ应激下，Gpxl敲低也阻止了O-GlcNAc表达的上调，同时GPX4水平也未如对照组那样升高。此外，Gpxl敲低条件下的ROS积累也显著减少。这些发现证实，Gpxl是氧化应激触发O-GlcNAc修饰和ISC增殖的关键节点，其缺失会削弱细胞对氧化压力的增殖应答能力。

3.6. 肠上皮细胞特异性Gpxl敲低及其对ISC增殖和细胞死亡的影响

干细胞的功能与其所处的微环境，特别是与分化细胞之间的相互作用密切相关。为了评估Gpxl在分化细胞中的作用，研究人员利用Myo1A-Gal4, tub-Gal80^ts, UAS-GFP系统（Myo1A^ts>）特异性在肠上皮细胞（Enterocytes, ECs）中敲低Gpxl。已知当ECs受损时，会触发ISC的补偿性增殖以修复上皮。与ISCs中敲低Gpxl抑制增殖的效果相反，ECs特异性敲低Gpxl反而导致了ISC增殖的增加。同时，在Myo1A-GFP阳性的ECs中，GPX4表达降低，并伴随着上皮细胞死亡（Cleaved Caspase-3阳性细胞）的增加。有趣的是，在ECs中敲低OGA则检测到强烈的GPX4表达。这些数据揭示了Gpxl功能的细胞类型特异性：在ISC区室中，Gpxl通过调节O-GlcNAc水平来精细调控增殖活性，防止过度增殖或增殖不足；而在分化的ECs中，Gpxl则主要通过抑制氧化应激诱导的凋亡来维持上皮屏障的完整性。ECs中Gpxl的缺失导致细胞死亡，进而引发ISC的补偿性增殖。这种区室特异性的功能凸显了Gpxl作为背景依赖性调节因子，协调干细胞动力学与分化细胞存活，从而在生理和应激条件下维持肠道稳态。

本研究系统地阐明了GPX4同源基因Gpxl在衰老和氧化应激条件下维持肠道干细胞稳态的核心作用。研究人员发现，Gpxl通过耦合营养感知信号O-GlcNAc修饰与DNA损伤应答（DDR），形成一个Gpxl–O-GlcNAc–DDR调控轴。在干细胞层面，Gpxl调控O-GlcNAc水平以平衡增殖；在分化细胞层面，Gpxl则防止氧化应激诱导的凋亡。这种细胞类型特异性的功能确保了肠道上皮在面临内外压力时能够维持再生能力与屏障功能的平衡。

该研究的创新之处在于首次将抗氧化酶GPX4/Gpxl与营养敏感的O-GlcNAc信号通路联系起来，并揭示了它们在整合氧化还原调控、营养感知和干细胞衰老中的关键作用。这不仅深化了我们对成年干细胞稳态维持机制的理解，而且为干预年龄相关性肠道功能障碍（如肠道屏障功能减弱、再生能力下降）和肿瘤性病变（如异常增生）提供了新的潜在治疗靶点。通过识别Gpxl/GPX4作为O-GlcNAc依赖性增殖程序中的关键节点，该研究提示靶向Gpxl–O-GlcNAc–DDR轴可能成为促进健康衰老和对抗肠道疾病的一种可行策略。未来研究将进一步揭示GPX4与O-GlcNAc之间直接的分子互作机制，以及该通路在不同生理病理条件下的动态调控网络。