PD-L1介导肺炎克雷伯菌感染巨噬细胞的抗原呈递与免疫调控机制研究

《Immunobiology》：Programmed cell death ligand 1 mediates antigen presentation, apoptosis, necrosis, and inflammatory response in Klebsiella pneumoniae-infected macrophages

本研究针对肺炎克雷伯菌（Kp）感染中PD-L1的免疫调控机制尚不明确的问题，通过构建Kp感染巨噬细胞模型及PD-L1敲低实验，发现PD-L1 knockdown可抑制巨噬细胞凋亡/坏死、增强吞噬功能并促进CD4+ T细胞活化，揭示了PD-L1通过调控抗原呈递（MHC II/CD80/CD86）和炎症因子（IL-1β/IL-6/TNF-α）介导Kp免疫逃逸的新机制，为抗Kp感染治疗提供了新靶点。

　　

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae, Kp）作为一种革兰氏阴性条件致病菌，不仅是社区获得性肺炎的主要元凶，更在免疫缺陷患者中引发高死亡率的侵袭性感染。随着高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Kp, hvKp）株系的出现和耐药性的蔓延，临床抗感染治疗面临严峻挑战。尽管既往研究多聚焦于Kp的耐药机制，但其如何逃逸宿主免疫清除的致病机制仍迷雾重重。尤其值得注意的是，在肿瘤免疫中扮演“刹车”角色的程序性死亡配体1（Programmed death-ligand 1, PD-L1），近年被发现可在细菌感染场景中异常高表达，提示其可能成为病原菌介导免疫抑制的“帮凶”。然而，PD-L1在Kp感染巨噬细胞过程中的具体功能及其对适应性免疫的调控作用，仍是未被深入探索的科学盲区。

为此，浙江大学医学院附属儿童医院重症监护病房团队在《Immunobiology》上发表研究，以经典Kp（classical Kp, cKp）和高毒力Kp（hvKp）感染小鼠单核巨噬细胞RAW264.7为模型，结合PD-L1基因敲低技术及Transwell共培养系统，首次系统揭示了PD-L1在Kp感染中调控巨噬细胞命运与CD4⁺ T细胞功能的多重作用。研究发现，Kp感染会显著上调巨噬细胞PD-L1表达，而抑制PD-L1不仅能降低细胞凋亡（表现为Bax、Cleaved Caspase 3下调）和坏死性凋亡（p-RIPK1/RIPK1、p-RIPK3/RIPK3、p-MLKL/MLKL下降），还可增强巨噬细胞对细菌的吞噬清除能力。更关键的是，PD-L1 knockdown逆转了Kp对巨噬细胞抗原呈递功能的抑制，显著提高MHC II、CD80、CD86表达水平，并促进共培养体系中CD4⁺ T细胞的活化（IFN-γ、TNF-α、IL-2分泌增加）并减少其凋亡。该研究从免疫调控新视角阐明了Kp感染中PD-L1的双刃剑角色，为靶向PD-1/PD-L1通路治疗耐药菌感染提供了理论依据。

在技术方法层面，作者首先通过PCR鉴定cKp（血清型K57）和hvKp（携带K2、rmpA、iroB毒力基因）菌株，并利用黏液粘度实验和荚膜多糖定量验证其表型差异。随后采用慢病毒shRNA转染构建PD-L1敲低的RAW264.7细胞株，通过qRT-PCR和Western blot验证敲低效率。研究通过流式细胞术、AO/EB染色及Western blot分析细胞凋亡/坏死指标；借助GFP标记菌株的荧光显微镜观察和FITC标记热灭活菌的流式 phagocytosis assay评估吞噬功能；通过ELISA和流式细胞术检测炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）及抗原呈递相关分子（MHC II、CD80、CD86）；最后利用Transwell共培养模型分析巨噬细胞与CD4⁺ T细胞的互作。

3.1. 菌株鉴定与细胞转染

研究通过PCR扩增证实cKp不携带K2、rmpA、iroB基因，而hvKp呈阳性，且hvKp荚膜产量更高、黏液粘度更强。成功构建PD-L1敲低的RAW264.7细胞模型，转染后PD-L1 mRNA和蛋白表达显著下降。

3.2. PD-L1敲低减轻Kp感染巨噬细胞的凋亡和坏死

Kp感染显著升高PD-L1表达，而shPD-L1干预后，流式细胞术和AO/EB染色显示凋亡细胞比例下降，Western blot检测到凋亡标志物（Bax、Cleaved Caspase 3）及坏死标志物（p-RIPK1/RIPK1、p-RIPK3/RIPK3、p-MLKL/MLKL）表达降低，提示PD-L1促进Kp感染引发的细胞死亡。

3.3. PD-L1敲低增强巨噬细胞吞噬功能

通过GFP标记菌株的时序观察发现，shPD-L1组巨噬细胞数量减少幅度较小，且流式 phagocytosis assay显示其吞噬活性和吞噬指数显著提升。免疫荧光进一步证实细胞内Kp数量增加，表明PD-L1抑制巨噬细胞的细菌清除能力。

3.4. PD-L1敲低促进巨噬细胞活化与抗原呈递

ELISA检测发现shPD-L1组炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平进一步升高；流式细胞术显示MHC II阳性细胞比例上升，CD80、CD86表达增强，说明PD-L1敲低可逆转Kp对巨噬细胞抗原呈递功能的抑制。

3.5. PD-L1敲低通过巨噬细胞增强CD4⁺ T细胞活化

Transwell共培养实验表明，与PD-L1敲低巨噬细胞共育的CD4⁺ T细胞凋亡率下降，且IFN-γ、TNF-α、IL-2分泌量显著增加，证实PD-L1敲低通过改善抗原呈递促进T细胞免疫应答。

本研究结论鲜明地指出：Kp感染通过上调巨噬细胞PD-L1表达，不仅加剧细胞凋亡/坏死、抑制吞噬功能，更关键的是削弱其抗原呈递能力，导致CD4⁺ T细胞活化受阻，最终助力细菌免疫逃逸。值得注意的是，相比cKp，hvKp感染虽引发更强细胞毒性，但其诱导的炎症反应和抗原呈递抑制反而较弱，提示不同毒力株可能采取差异化免疫逃逸策略。尽管研究存在使用永生化细胞株、热灭活菌模拟吞噬等局限性，但其首次将PD-L1功能拓展至Kp感染场景，揭示了该分子在天然免疫与适应性免疫交叉调控中的枢纽作用。靶向PD-L1或许能打破Kp感染的免疫僵局，为多重耐药菌感染提供新的免疫治疗思路。