球磨预处理联合松解素样蛋白PcaLOOL12对纸浆纤维形态及可及性的协同效应研究

《Industrial Crops and Products》：Effects of sequential ball milling and loosenin-like protein treatment on pulp fibers

本研究针对纸浆纤维结构致密、可及性差的问题，探讨了机械球磨预处理联合新型真菌来源松解素样蛋白PcaLOOL12处理的协同效应。结果表明，该组合处理能有效促进纤维原纤化、提高保水值，并通过表面剥离作用改善纤维可及性，为生物基产品的绿色开发提供了新策略。

　　

在追求可持续发展的今天，利用可再生生物质资源开发新材料已成为全球焦点。纸浆纤维，作为一种丰富的纤维素来源，在造纸、纺织、生物复合材料等领域具有广泛应用前景。然而，天然纤维素纤维固有的致密结构和高结晶度，构成了其高效利用的主要障碍，这种现象被称为“纤维素的顽固性”。传统的预处理方法，如强碱处理或高温高压，虽然能有效破坏纤维结构，但往往伴随着高能耗、环境污染以及对设备腐蚀性强等问题。因此，开发温和、环保的新型预处理技术，在不大幅降低纤维长度的前提下，有效打开纤维结构、提高其反应可及性，是生物质精炼领域亟待解决的关键挑战。

在此背景下，发表在《Industrial Crops and Products》上的这项研究，提出了一种创新的组合策略：将机械球磨与一种非水解性蛋白质——松解素样蛋白的处理相结合。研究人员设想，温和的机械力可以初步“松动”纤维结构，为后续蛋白质的作用提供通道；而松解素样蛋白则能特异性地作用于纤维素分子间的氢键网络，进一步促进纤维的“松弛”和原纤化。这种在常温、近中性pH水相环境中进行的处理过程，有望避免传统方法的弊端，为实现纤维素的绿色改性开辟新途径。

为了验证这一设想，研究团队设计了一系列实验。他们选用从未干燥过的桦木硫酸盐浆纤维作为研究对象，这反映了利用普通造纸级纸浆而非昂贵的溶解浆来开发高价值产品的趋势。研究首先通过实验室规模的连续球磨设备，在湿态下对纤维进行不同能量（50, 100, 150 kWh/t）的预处理。基于初步结果，他们选择了50 kWh/t这一相对温和的能量水平进行后续与蛋白质的联合处理实验。所使用的蛋白质是一种名为PcaLOOL12的真菌来源松解素样蛋白，通过毕赤酵母重组表达系统规模化生产并获得纯化。蛋白质处理在室温（23°C）、pH 5的醋酸钠缓冲液中进行，处理时间（2-72小时）和蛋白质添加量（相对于纤维绝干重的0.5-10 wt%）是考察的主要变量。

研究团队运用了多种表征技术来评估处理效果。纤维形态分析仪用于测量纤维的长度、宽度和原纤化程度。通过离心法测定保水值，以评估纤维的溶胀行为。采用差示扫描量热法进行热孔计分析，以探测湿态纤维纳米级孔隙结构的变化。此外，还开发了一种基于流变学的溶解扭矩反应测试方法，通过监测纤维在铜乙二胺溶剂中溶解过程的扭矩变化，来间接评价纤维的可及性和溶解性能。

3.1. 球磨及后续PcaLOOL12处理对纤维形态的影响

研究结果显示，单纯的球磨处理显著改变了纤维的形态。随着 refining energy (精炼能量) 的增加，纤维的宽度从未处理的22 μm增加至150 kWh/t处理后的26 μm，表现出纤维被压扁的效应。然而，纤维的长度保持相对稳定，从初始的约1 mm仅略微下降至0.9 mm。这表明在水相中进行球磨主要引起的是原纤化而非纤维的断裂，与一些干法球磨研究结果不同，凸显了水介质对保护纤维长度的作用。当纤维经过50 kWh/t球磨预处理后，再接受PcaLOOL12处理时，纤维长度依然没有显著变化，这符合松解素非水解活性的特性。值得注意的是，联合处理对纤维长宽比产生了与单纯球磨相反的效果，使其略有增加。研究人员未观察到类似其他松解素报告中提到的纤维“气球化”现象，即使辅以超声波处理也未出现，说明PcaLOOL12的作用方式可能存在差异。

3.2. 原纤化

机械处理本身就能强烈促进原纤化。与未处理纤维相比，50 kWh/t和150 kWh/t球磨处理使原纤化程度分别提高了62%和285%。显微镜图像清晰地显示了纤维表面分丝帚化的加剧。联合处理则进一步增强了这一效果。研究发现，PcaLOOL12的添加剂量和处理时间共同影响着原纤化程度。使用10 wt%的蛋白质处理48小时后，原纤化水平达到最高，比仅经球磨预处理的参照样品提高了1.6倍。延长处理时间至72小时，即使使用较低剂量的蛋白质（0.5-2.5 wt%）也能达到类似的高原纤化水平，表明时间可以补偿剂量的不足。相比之下，使用参考蛋白质牛血清白蛋白进行处理则没有效果，证明了PcaLOOL12作用的特异性。研究人员推测，这种原纤化增强效应可能源于蛋白质破坏了纤维素微纤丝之间的非共价键连接，导致了纤维表面的分层和剥离。

3.3. 纤维孔隙率

利用热孔计法对湿态纤维的孔隙结构进行分析后发现，无论是单纯的球磨处理还是联合蛋白质处理，对纤维的总孔隙体积和纳米级孔隙（以非冻结水量表征）的影响均十分有限。总孔隙体积仅从未处理纤维的0.7 mL/g轻微增加至100 kWh/t以上处理后的约0.8 mL/g。非冻结水量在不同处理间波动（0.24-0.35 mL/g），但未呈现明显的规律性显著增加。这一结果有些出乎意料，因为通常认为机械处理会增加孔隙。对此，研究人员引用前人研究指出，显著的微孔性变化往往与纤维结构的深度破坏（如分子量大幅下降）相关。本研究中相对温和的处理条件可能不足以显著改变纤维内部的纳米孔隙结构，从而暗示PcaLOOL12的作用更可能集中于纤维表面或较大尺度的结构松散。

3.4. 水保留

保水值的测试结果与形态学观察相呼应。单纯的球磨处理使保水值随 refining energy 增加而上升，在最高能量下比未处理纤维提高了30%以上，这归因于原纤化增加和纤维结构破坏带来的溶胀能力提升。联合处理也带来了额外的增益，经5 wt% PcaLOOL12处理24小时后，保水值进一步提高了约5%。这种保水能力的增强与观察到的原纤化程度提高相一致，但由于孔隙率未见显著变化，研究人员认为保水值的改善主要源于表面原纤化增加所带来的比表面积扩大。

3.5. 溶解性

溶解扭矩反应测试的结果呈现了有趣且复杂的现象。与预期相反，所有经过PcaLOOL12处理的样品，其在CED溶剂中的溶解性能均出现了下降，表现为达到的扭矩平台值降低以及初始溶解速率减慢。例如，经10 wt% PcaLOOL12处理72小时的样品，其扭矩平台值从参照样品的约186 μNm降至102 μNm。研究人员对此提出了几种可能的解释：一方面，增强的原纤化可能导致纤维间更容易发生缠结和聚集，形成更难以被溶剂渗透和拆解的网络结构；另一方面，蛋白质本身在纤维表面的吸附可能会改变纤维与溶剂之间的相互作用。纤维素的溶解是一个复杂过程，受到氢键、疏水作用以及拓扑缠结等多种因素影响。高度的原纤化在提高可及性的同时，也可能增强了这些阻碍溶解的因素。此外，流变测试中的剪切速率可能需要针对处理后的纤维状态进行优化，以有效打破可能形成的缠结团簇。

综上所述，本研究系统地评估了顺序球磨与松解素样蛋白PcaLOOL12处理对纸浆纤维的影响。研究结论表明，湿态球磨作为一种机械预处理，能有效诱导纤维原纤化和扁平化，而不显著缩短纤维长度。后续的PcaLOOL12处理能够进一步促进原纤化和提高保水值，显示出对纤维结构的表面剥离作用。然而，这种处理并未显著改变纤维内部的纳米级孔隙结构，并且出乎意料地降低了纤维在特定溶剂中的溶解性，这可能与处理引起的纤维聚集或流变行为改变有关。

这项研究的重要意义在于它展示了一种在温和条件下（常温、近中性pH、水相）对纤维素纤维进行物理生物联合改性的可行性。该方法避免了传统高强度化学或热处理的环境负担，为基于普通纸浆开发高附加值生物基产品（如纳米纤维素、功能性材料）提供了新的技术思路。尽管在溶解性方面观察到了需要进一步探究的复杂现象，但研究揭示的纤维形态可控调节潜力，特别是表面原纤化的增强，对于改善纤维在复合材料中的界面结合、促进酶解糖化或化学改性反应等方面具有明确的应用价值。未来的研究可以深入探索蛋白质作用的具体机制，优化处理参数以平衡可及性与溶解性，并将此策略应用于更广泛的生物质原料和终端产品开发中。