抗菌肽CATH-1通过靶向丝氨酸/苏氨酸激酶抑制猪链球菌荚膜合成的双重抗菌机制研究

《International Journal of Antimicrobial Agents》：Antimicrobial peptide CATH-1 combats Streptococcus suis by targeting the serine/threonine kinase

本研究发现鸡源抗菌肽CATH-1通过破坏细菌膜完整性（杀菌作用）和靶向丝氨酸/苏氨酸激酶（STK）抑制荚膜多糖（CPS）合成（抗毒力作用）的双重机制对抗猪链球菌（S. suis），且不易诱导耐药性。该研究为开发以STK为靶点的新型抗感染药物提供了理论依据。

　　

Highlight

CATH-1通过破坏细菌膜和靶向STK发挥双重抗菌作用。

CATH-1与STK的直接相互作用通过多种实验验证。

STK缺失显著削弱了CATH-1的体内外抗菌效果。

Section snippets

肽类和抗生素

鸡源抗菌肽CATH-1由中国肽业（上海）采用Fmoc化学法合成，并通过反相高效液相色谱纯化，纯度>95%（序列：RVKRVWPLVIRTVIAGYNLYRAIKKK）。使用的常规抗生素包括氨苄青霉素和庆大霉素，购自上海麦克林生化科技有限公司。储备溶液用无菌水配制。

细菌菌株

本研究中使用的猪链球菌（S. suis）SC19菌株由王向如教授（华中农业大学兽医学院）惠赠。通过连续传代培养评估CATH-1诱导耐药性的潜力。

统计分析

数据表示为每组三个独立实验（体外）的平均值±标准误（SEM）。动物实验每组使用五只小鼠。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）分析组间统计学显著性。统计学显著性表示为 P ≤ 0.05, P ≤ 0.01, P ≤ 0.001, ns=无显著性。

CATH-1预处理的猪链球菌不产生耐药性

我们之前的研究表明，CATH-1对猪链球菌的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）分别为5 μM和10 μM。本研究调查了亚抑菌浓度（sub-MIC，0.625 μM和1.25 μM）的CATH-1的抗猪链球菌效力，以及亚抑菌浓度的CATH-1是否会诱导耐药性。如图1A、1B所示，1/8 MIC的CATH-1在培养6小时前轻微抑制细菌生长，而1/4 MIC的CATH-1则显著抑制细菌生长。我们选择1/8 MIC作为细菌的预处理浓度，培养6小时后，将细菌转移到含有1×MIC CATH-1的新鲜培养基中。如图1C所示，与未预处理的对照组相比，经过15代连续传代后，CATH-1预处理组的MIC值没有变化。这些结果表明，亚抑菌浓度的CATH-1不会诱导猪链球菌产生耐药性。

讨论

猪链球菌（S. suis）导致人和猪的严重感染，造成人类死亡和养猪业的巨大经济损失。抗生素的过度使用导致多重耐药菌株的出现，并延缓了对抗猪链球菌感染的新型抗菌剂的开发。因此，迫切需要探索具有新靶点的抗感染药物以克服耐药性。属于抗菌肽（AMPs）的Cathelicidins是先天免疫系统的重要组成部分，因其广谱抗菌活性和不易诱导耐药性而成为传统抗生素的有前景的替代品。我们的研究发现，鸡源抗菌肽CATH-1对猪链球菌SC19具有有效的抗菌活性，且不易诱导耐药性。通过蛋白质组学和代谢组学分析，我们发现CATH-1通过调节包括细胞膜、细菌毒力和能量代谢在内的多种途径发挥抗菌作用。机制上，CATH-1通过破坏细菌膜完整性和靶向丝氨酸/苏氨酸激酶（STK）以抑制荚膜多糖（CPS）合成，发挥双重抗菌作用。分子对接、GST亲和分离实验、细胞热位移分析（CETSA）和药物亲和反应靶点稳定性（DARTS）实验均证实了STK与CATH-1之间的相互作用。此外，在体外杀菌实验和体内感染模型中，stk基因的缺失削弱了CATH-1的抗猪链球菌功效，表明STK是CATH-1的潜在靶点。我们的研究揭示了CATH-1的一个新的抗菌靶点，为开发抗菌肽作为抗感染药物提供了新的见解。