在城市河流中用于监测宿主相关粪便标志物的被动采样器的原位校准

《ACS ES&T Water》：In Situ Calibration of Passive Samplers for Monitoring Host-Associated Fecal Markers in an Urban River

被动采样技术在城市河流中检测Carjivirus、PMMoV、ToBRFV和GFD等粪源污染标记物，对比Torpedo和MSTFlow两种膜基采样器的吸附动力学。结果显示，采样器在8-16小时内达到病毒吸附平衡，采样速率范围为0.68-6.29 mL/h，GFD因尺寸较大需64小时达到平衡。被动采样具有高效、低成本、连续监测优势，为水体微生物污染监测提供新方法。

　　本研究探讨了两种基于膜的被动采样器（Torpedo和MSTFlow）在城市河流环境中，用于检测污水相关的微生物污染标志物（如Carjivirus、植物辣椒轻斑点病毒PMMoV、番茄褐斑病毒ToBRFV）以及禽类粪便污染标志物（如GFD）的性能。实验采用了第一阶动力学模型来描述采样器对这些标志物的吸附特性，并将其结果与平行的复合采样和时间加权自动采样进行了比较。研究结果表明，被动采样作为一种敏感、低成本且低维护的连续微生物水质监测方法，在环境水体中具有广阔的应用前景。

在研究中，两种采样器均表现出初始滞后期（病毒为0至8小时），并在部署后16小时内达到平衡，唯独GFD例外。采样速率方面，PMMoV的采样速率最高，分别为MSTFlow和Torpedo采样器的6.29 mL/h和5.11 mL/h，其次是Carjivirus（4.63和3.63 mL/h），ToBRFV（2.17和1.22 mL/h）以及GFD（0.68 mL/h在Torpedo采样器中）。达到平衡时，两种采样器配置分别在每毫升抓取水样中积累了23到220倍的目标基因拷贝数，具体取决于采样器和病毒种类。这些发现表明，被动采样方法在持续监测环境水体中的微生物污染方面具有显著优势，其高灵敏度、低维护和经济性使其成为传统水质监测方法的有力补充。

被动采样技术旨在通过长时间积累污染物来提供一种对水体中污染物的累积测量方法，减少传统离散抓取样本在时间和空间上的波动，从而提高对低丰度病原体的检测限。这种技术特别适用于无法使用昂贵自动采样器或需要避免频繁采集样本的场景。MSTFlow和Torpedo采样器的设计旨在优化对微生物的捕获效率，其中Torpedo采样器已被广泛用于污水中SARS-CoV-2及其他病毒的监测，而MSTFlow则是新开发的一种结构，旨在提高采样效率并便于维护。两种采样器均使用了负电荷膜作为吸附材料，这种膜在污水处理和环境监测中已被证明具有良好的重现性和灵敏度，能够有效捕获病毒并避免抑制物的积累。

研究中采用了多种采样方法，包括抓取样本、时间加权自动采样和复合采样。抓取样本和时间加权自动采样（称为Sipper）均在部署后1、4、8、12、24、48和72小时进行采集。由于设备故障，最终的48至72小时时间加权样本未能完整采集。所有样本在采集后立即存放在冰盒中，并在3小时内运送到实验室进行处理。抓取和时间加权样本在到达后立即过滤，并将膜卷起后存入7 mL珠磨管中，以?20°C保存。被动采样器的膜则使用无菌镊子小心取出，同样卷起并存入7 mL珠磨管中，与抓取和时间加权样本一起冷冻保存。此外，将抓取样本中每天的100 mL分样进行混合，以形成72小时的复合水样，同样进行过滤和保存。

在水样浓缩和核酸提取方面，研究采用了改良的吸附-提取（AE）方法。所有样本（包括抓取、复合和24小时时间加权水样）均通过0.45 μm的混合纤维素酯膜进行过滤。核酸提取则使用了Qiagen RNeasy PowerWater Kit，省略了DNase处理步骤，以获取总核酸。提取的核酸随后用无核酸酶水以150 μL进行洗脱，并在?20°C保存，以备后续的qPCR和RT-qPCR分析。

qPCR和RT-qPCR分析采用了一系列已发表的检测方法，用于分析与宿主相关的粪便标志物，包括Carjivirus、PMMoV、ToBRFV和GFD。所有实验均采用三重重复，以确保数据的可靠性。反应混合物中包含引物、探针和PCR试剂，反应条件和参数均在补充表格ST3中列出。反应在Bio-Rad CFX96热循环仪中进行，同时包括三重阴性和阳性对照，以确保实验的准确性。标准曲线的检测范围为3 × 10⁶至3个基因拷贝，用于量化粪便标志物。基线和阈值均设定在50至175相对荧光单位（RFU）之间，以确保检测的一致性。

为了评估检测性能，研究使用了最低检测限（ALOD）和PCR抑制测试。PCR抑制测试通过在提取的核酸样本中加入已知拷贝数的MHV RNA或Oncorhynchus keta DNA来确定。若样本的Cq值与参考Cq值相差不超过2个循环，则认为无PCR抑制。抑制的样本则需要稀释后再进行重新分析。为了减少实验中的污染，核酸提取和RT-qPCR/qPCR实验分别在不同的实验室进行。每一批次的样本均包括膜空白、过滤空白和试剂空白，以确保实验的准确性。

研究中采用了一阶单室动力学模型来描述粪便标志物在被动采样器上的积累过程。该模型通过非线性最小二乘法回归进行参数估计，使用Graphpad Prism Version 10.4.2软件进行分析。评估模型拟合效果时，使用了RMSE、标准误差（Sy.x）、R²值和95%置信区间。模型中的参数包括N_s（采样器上检测到的目标基因拷贝数）、K_sw（采样器-水分配系数）、C_w（抓取水样中的平均浓度）、m_s（采样器数量）、R_s（采样速率）以及t₀（无可检测病毒载量的最后时间点）。通过这些参数，可以计算出达到平衡的时间（t_eq）。

在结果分析中，研究发现所有粪便标志物在被动采样器上的积累模式相似，均经历了相对较短的滞后期，随后逐渐增加直到达到平衡。Carjivirus在两种采样器上均未观察到滞后期，且达到平衡的时间最短，仅为2.5小时。PMMoV在两种采样器上的滞后期分别为8至12小时，达到平衡的时间为16小时以内。ToBRFV则表现出较长的滞后期，分别为1小时和4小时，达到平衡的时间分别为5.9小时和11.2小时。GFD的积累则较为缓慢，未在前24小时内检测到，且达到平衡的时间长达64小时。这表明，不同标志物在采样器上的吸附行为存在显著差异，可能与它们的电荷性质、大小和水体中的环境条件有关。

通过模型分析，研究得出了不同采样器的采样速率和平衡时间。对于Carjivirus，MSTFlow和Torpedo采样器的采样速率分别为3.63和4.63 mL/h，K_sw分别为1.71和1.76。PMMoV的采样速率分别为5.11和6.29 mL/h，K_sw分别为7.92和7.71。ToBRFV的采样速率分别为1.22和2.17 mL/h，K_sw分别为2.98和2.79。GFD的采样速率较低，仅为0.68 mL/h。这些结果表明，不同标志物在采样器上的吸附行为存在差异，可能与它们的物理化学特性有关。

研究还发现，采样器的平衡时间与标志物的特性密切相关。例如，Carjivirus和PMMoV的平衡时间较短，而ToBRFV和GFD则较长。这可能与它们的电荷性质、水体中的浓度以及采样器的设计有关。Carjivirus具有较高的浓度，可能有助于其快速吸附，而ToBRFV和GFD则由于其较大的体积和较低的浓度，导致吸附过程较慢。

此外，研究还探讨了不同采样方法之间的比较。被动采样在检测低丰度病原体方面表现出较高的灵敏度，尤其是在PMMoV和ToBRFV的检测中，浓度因子超过200倍，意味着一个被动采样器检测到50个基因拷贝相当于需要超过1升的抓取样本才能达到相同的检测效果。这表明被动采样在减少样本采集和处理需求方面具有显著优势，特别是在大规模环境监测中。

尽管研究取得了积极成果，但仍存在一些挑战。例如，研究主要集中在相对城市化的河流环境中，而在更复杂的或高浊度的水体中，被动采样器的有效性仍需进一步验证。此外，当前的采样器在短时间内达到平衡，这可能限制其在高浓度波动环境中捕捉时间变化的能力。为了克服这些限制，未来的研究应关注延长动力学模式的采样时间，以实现更全面的监测，并开发适用于多种水体和微生物目标的被动采样框架。

综上所述，本研究展示了基于膜的被动采样器在城市河流环境中检测微生物污染标志物的有效性。被动采样方法不仅提供了高效、敏感和低成本的监测手段，还为环境病原体监测和公共卫生保护提供了新的工具。研究结果为被动采样技术的进一步应用奠定了基础，并推动了其在不同水体和微生物目标中的推广。未来的研究应继续探索被动采样器在复杂环境中的表现，并优化其设计以提高检测的准确性和可靠性。