一种基于CRISPR干扰技术的多重、目标导向的表型筛选平台，用于检测脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）

《ACS Infectious Diseases》：A Multiplexed, Target-Based Phenotypic Screening Platform Using CRISPR Interference in Mycobacterium abscessus

本研究开发了基于CRISPRi干扰技术的改进版PROSPECT策略，用于高效筛选抗难治性病原菌Mycobacterium abscessus的化合物。通过构建60个靶向28个关键基因的CRISPRi突变体库，对782种已知抗结核活性化合物进行多plex筛选，发现106个活性化合物。重点解析了异烟肼耐药机制，揭示其涉及KatG酶活性不足（较结核分枝杆菌低30倍）、InhA靶点对药物结合亲和力差异（MIC90分别为1.6 μg/mL和0.034 μg/mL），以及多重耐药泵（MAB_2263c、MAB_0069等）协同作用导致的药物积累障碍。该策略显著提升抗生素发现效率（64%准确率），为克服M. abscessus耐药性提供了新工具。

　　在当今的医学领域，一种名为*Mycobacterium abscessus*的细菌感染问题日益突出，给临床治疗带来了巨大挑战。这种细菌以其对多种抗生素的广泛耐药性而著称，包括许多传统上用于治疗其他结核病原体的药物。其耐药机制复杂，涵盖内在、可诱导以及获得性抗药性，使得现有抗生素对*M. abscessus*的疗效大打折扣。更令人担忧的是，新型化合物的发现进展缓慢，进一步凸显了开发创新药物筛选策略的迫切需求。为此，研究人员提出了PROSPECT这一新策略，旨在通过测量小分子与一组细菌突变体之间的化学-遗传相互作用，识别具有高敏感性的全细胞活性化合物。然而，传统的PROSPECT方法依赖于蛋白质降解或启动子替换等较为繁琐的技术手段，限制了其在*M. abscessus*中的应用。为了解决这一问题，研究团队引入了CRISPR干扰（CRISPRi）技术，以更高效地生成针对细胞壁合成或位于细菌表面的特定基因缺失突变株。这一改进使得PROSPECT策略能够更广泛地应用于包括*M. abscessus*在内的多种细菌，为抗生素的早期发现提供了新的可能性。

*Mycobacterium*属包含超过200种环境和病原性物种，其中一些如*M. tuberculosis*属于缓慢生长的种类，而另一些如*M. smegmatis*则属于快速生长的类型。除了*M. tuberculosis*和*M. leprae*等已知的致病菌外，其他种类被统称为非结核分枝杆菌（NTMs）。近年来，NTMs感染的发病率在全球范围内持续上升，尽管诊断和报告手段仍存在局限。这种感染范围广泛，包括皮肤和软组织感染，以及肺部疾病。尽管某些风险因素可能增加患者感染NTMs的可能性，如慢性肺部疾病（如囊性纤维化、慢性阻塞性肺疾病）或免疫缺陷状态，但感染也越来越多地出现在健康个体中。这一趋势表明，NTMs感染已成为一个日益严重的公共卫生问题，具有明显的临床需求。

*M. abscessus*因其高度的耐药性而尤其引人注目，成为难以治疗的病原体之一。目前的治疗方案多为经验性用药，通常需要联合多种药物。然而，即使在这样的治疗策略下，*M. abscessus*的治疗成功率依然较低，这主要归因于其强大的耐药机制。许多原本用于治疗其他感染的抗生素在面对*M. abscessus*时都失去了作用，包括一些传统的抗结核药物如异烟肼和利福平。因此，*M. abscessus*被称为“难以治愈的噩梦”，突显了其作为新兴病原体的临床重要性。

由于缺乏有效的治疗手段，*M. abscessus*的药物发现流程显得尤为不足。传统的小细胞筛选方法在识别候选分子方面收效甚微，而基于生化靶向的化学筛选方法虽然能产生高靶向性的抑制剂，但往往缺乏全细胞活性。因此，针对*M. abscessus*的药物开发主要集中在已有抗菌药物的再利用（如氯法齐明和贝达喹啉）、抗结核候选药物的再利用以及寻找能够绕过内在耐药机制的化合物或组合（如利福布汀和β-内酰胺酶组合）。显然，迫切需要新的筛选策略，以提高识别针对*M. abscessus*的新化合物的能力，同时能够同时识别其潜在的靶点或作用机制。

在此背景下，研究人员最近提出了一种名为PROSPECT的新型抗生素发现方法。PROSPECT通过筛选一组基因被修饰的突变株，每株缺失不同的关键靶点，从而识别新的具有生物活性的分子。首次在*M. tuberculosis*上的全基因组应用涉及对一组经过修饰的突变株进行多路复用筛选，每个突变株缺失一个不同的关键靶点。通过这种方式，一些突变株由于靶点缺失而表现出对某些化合物的超敏反应，从而即使这些化合物在野生型菌株中没有活性，也能被识别出来。这不仅提高了活性化合物的发现数量，还能够将化合物与潜在的靶点或作用机制相关联，为后续的化学优化提供生物学依据。在另一个简化版本的PROSPECT（称为mini-PROSPECT）中，研究人员通过筛选一组针对外膜靶点的突变株，识别了对*Pseudomonas aeruginosa*有效的探针。

为了提高PROSPECT在*M. abscessus*中的应用效率，研究团队引入了CRISPRi技术。与传统的蛋白质降解或启动子替换方法相比，CRISPRi提供了一种更为简便的方式来生成基因缺失的突变株。通过调整sgRNA的序列，可以轻松地控制目标基因的表达水平，从而生成具有不同敲低程度的突变株。此外，CRISPRi引导序列本身可以作为突变株的条形码，使得在多路复用筛选中能够更高效地识别不同突变株的生长情况。研究团队选择了28个关键基因，这些基因主要涉及细胞壁合成或位于细菌表面，因为这些基因的缺失可能更容易导致细胞膜通透性改变，从而促进小分子药物的积累。通过这种方法，研究人员成功构建了60个突变株，并在一项初步的筛选实验中测试了782种已知具有抗菌活性的化合物。

在筛选过程中，研究人员采用了多种策略来提高筛选的准确性和效率。首先，他们设计了一种基于标准化生长率（GR）的评估方法，通过将治疗后的生长率与未处理的生长率进行比较，排除了由于基线生长率差异导致的偏差。此外，他们还引入了标准化的生长率（DSGR）作为衡量化合物与特定突变株之间相互作用的指标，以确保筛选结果的可比性。为了进一步验证筛选结果，研究人员对部分化合物-靶点相互作用进行了单独验证，使用OD600测定法评估其对突变株的敏感性。结果显示，约58%的阳性相互作用得到了验证，而67%的阴性相互作用也得到了确认，表明该筛选策略具有较高的准确性。

值得注意的是，在筛选过程中，研究人员发现异烟肼及其类似物在*M. abscessus*的inhA突变株中表现出显著的活性，尽管传统观点认为异烟肼对*M. abscessus*无效。异烟肼是一种一线抗结核药物，其作用机制依赖于催化过氧化物酶KatG的激活，随后形成NAD+加合物，从而抑制InhA，这是一种参与脂肪酸生物合成的关键酶。尽管异烟肼在*M. tuberculosis*中表现出良好的活性，但在其他分枝杆菌中通常被认为无效，因为其KatG同源物无法有效激活异烟肼。然而，*M. abscessus*的inhA突变株对异烟肼的敏感性表明，其KatG同源物仍具有一定的催化活性，至少能够部分激活异烟肼。这一发现揭示了*M. abscessus*对异烟肼的内在耐药性可能由多个因素共同作用，包括KatG活性的降低、InhA对异烟肼-NAD+加合物的耐受性，以及复杂的外排泵系统，这些系统可能有效降低药物在细胞内的浓度。

通过进一步的实验，研究人员确认了这些内在耐药机制的具体作用。例如，当*M. abscessus*的KatG同源物被过表达时，其对异烟肼的敏感性有所提高，但与*M. tuberculosis*的KatG相比，其催化活性仍较低。此外，*M. abscessus*的InhA同源物对异烟肼-NAD+加合物的抑制作用较弱，而外排泵系统的激活则进一步降低了药物的积累。这些结果表明，*M. abscessus*对异烟肼的耐药性是多因素的，不能简单归因于KatG活性的缺失。

综上所述，研究团队通过将CRISPRi技术与PROSPECT策略相结合，成功开发了一种新的筛选方法，用于识别针对*M. abscessus*的活性化合物。这种方法不仅提高了筛选的敏感性和效率，还为药物开发提供了新的思路和工具。通过多路复用筛选，研究人员能够更全面地探索潜在的药物靶点，并识别那些在野生型菌株中无效但在突变株中有效的化合物。这些化合物可以作为进一步开发的起点，通过化学优化获得对野生型菌株的有效性。此外，该方法的广泛应用潜力也为其他临床相关细菌的药物开发提供了借鉴，特别是在应对日益严重的抗生素耐药问题方面。尽管需要进一步的研究来完善这一策略，但CRISPRi-based PROSPECT无疑为加速早期抗生素发现提供了一个重要的平台。