基于PRM-PASEF的定量分析与异构体模型：用于帕金森病患者血浆脂质组的广泛覆盖研究

《Analytical Chemistry》：prm-PASEF-Based Quantification and Isomeric Model for Extended Coverage of Human Plasma Lipidome in Parkinson’s Disease

临床脂质组学平台开发及帕金森病表型研究

　　本研究介绍了一种临床脂质组学平台，该平台基于碎片化定量技术，结合了平行反应监测（PRM）和并行积累串联碎片（PASEF）方法，用于脂质的定量分析。该方法开发了一个称为“SN回归模型”的同分异构体模型，通过特定的PASEF-碎片离子模式，用于在无需预衍生化的情况下，对共洗脱的sn位置异构体进行定量分析。通过PASEF同分异构体脂质组学，可以实现对176种共洗脱脂质异构体在色谱和/或离子迁移率（IM）维度的分辨率和定量分析，从而将脂质组的定量覆盖范围扩展到481种血浆脂质，涵盖14种脂质亚类，其CV值低于40%。该方法在临床研究中得到了验证，特别是在对帕金森病（PD）患者的详细脂质组学表型分析中，揭示了新的生化通路变化，并有助于对患者的分层分析。此外，该方法具备高通量、深度定量覆盖能力，适用于高度结构解析的脂质组，对改善帕金森病亚组和其他脂质失调相关疾病的诊断和理解具有重要意义。

近年来，脂质组学领域取得了显著进展，这主要得益于高分辨率质谱（HRMS）技术的不断进步。HRMS提供了多种采集模式，如数据依赖采集（DDA）在MS2至MSn模式下，数据独立采集（DIA），PRM，以及离子迁移率（IM），这些模式各自具有独特的优点，可以结合用于不同应用中脂质的广泛结构识别。然而，脂质组学分析中的一个主要挑战是，对共洗脱的同分异构体和等质量同位素脂质进行相对和/或绝对定量。对于甘油磷脂（PL）来说，功能上最重要的同分异构体包括：（i）sn位置异构体，由甘油骨架上的sn1或sn2碳原子上的脂肪酰基（FA）取代产生；（ii）组成异构体，其sn1和sn2位置上连接的FA链类型不同；以及（iii）双键（DB）位置和/或立体化学不同的异构体。通常，共洗脱的异构体或等质量同位素脂质是基于MS1前体离子峰面积作为单一簇进行定量。在复杂的基质中，如人血浆，可以使用多重反应监测（MRM）或基于类别的碎片化模式对不同类别的等质量同位素脂质进行定量。为了识别和定量DB位置异构体，已开发了如臭氧裂解等脂质衍生化策略。然而，这些策略在使用短梯度或直接进样质谱进行高通量分析时，会增加基质的复杂性。对于单乙酰基（lyso）甘油磷脂的sn位置异构体，可以通过反相液相色谱（RPLC）轻松分辨。然而，大多数在双FA取代的甘油磷脂中的sn1和sn2酰基位置及组成异构体仍然无法通过RPLC解析。Ekroos等人提出了一种基于MSn的Shotgun方法，通过结构特异性碎片离子对这些位置异构体进行相对定量分析。甘油磷脂的识别依赖于其FA链在sn1和sn2位置上产生的羧酸盐碎片离子，如[M-H]?和[M+HCOO]?。这些碎片离子在同分异构体纯的PLs中呈现出固定的相对比值。通常，sn2的RCOO?碎片离子的丰度高于sn1的RCOO?碎片离子，但这一规律在某些脂质类别中有所不同，如甘油磷脂酸（PA）、甘油磷肌醇（PI）和甘油磷丝氨酸（PS）。因此，这些碎片离子的丰度比值的变化可以揭示sn位置异构体的存在，从而有助于其相对定量分析。

将离子迁移率（IM）整合到HRMS中，如在捕获离子迁移率（TIMS）设备上，可以部分解决共洗脱异构体的问题。观察到，单乙酰基甘油磷脂的sn异构体可以通过离子迁移率进行区分，其中sn2位置异构体的碰撞截面（CCS）值通常高于sn1位置异构体，这可以用于确认注释。然而，在常规分辨率模式（R_p - 100）下，离子迁移率无法解析双FA取代PL中的sn位置异构体。Koomen和Xu等人开发了高分辨率解复用（HRdm）技术，用于在复杂混合物中识别共洗脱异构体，特别是在R_p - 250的高分辨率下。然而，该工作流程尚未实现用于定量，并且依赖于PNNL预处理器来解复用离子迁移率数据，限制了其在其他厂商数据格式中的使用。随着脂质组学领域的不断发展，需要开发具有厂商中立性的工作流程。

目标分析方法，如MRM和PRM，可以通过脂质结构的独特碎片离子实现定量，从而区分共洗脱异构体。此外，PRM与PASEF结合的PRM-PASEF方法，利用目标前体的选择，基于保留时间（RT）、质荷比（m/z）、碰撞能量和离子迁移率，提高了选择性和灵敏度。这些方法允许对多个前体-碎片离子过渡进行监控，从而实现个体异构体的定量分析。

本研究中，我们提出了一种基于PRM-PASEF的目标脂质组学分析方法，能够在常规临床分析中实现更广泛的脂质组覆盖。我们利用先前研究中确定的共洗脱脂质，构建了一个工作流程，用于4D-TIMS基于的常规临床血浆脂质组分析。通过分析这些共洗脱异构体的特征碎片离子，如[M–H]?和[M+HCOO]?加合物离子，用于其识别和定量。利用PRM-PASEF获得的碎片离子丰度，我们开发了一个“SN回归模型”，用于PC、甘油磷乙醇胺（PE）和PS脂质类中的sn位置异构体定量。该模型考虑了不同基质效应、碎片化效率、MS2光谱质量和生物混合物的动态范围等变量。通过PRM-PASEF和“SN回归模型”，我们能够常规分析和定量481种脂质，涵盖14种脂质类别，包括112种FA组成异构体和64种sn位置异构体。我们将该方法应用于帕金森病患者的队列，并展示了其在深度脂质定量覆盖、PD表型分析和深入通路解析方面的优势。

在实验部分，我们使用了帕金森病队列的血清样本，这些样本符合所有相关的伦理规定，并遵循德国莱茵兰-普法尔茨州的准则。样本准备采用液-液萃取（LLE）方法，使用800 μL MTBE/甲醇（10:3，体积比）和200 μL 0.1%甲酸进行萃取。将20 μL NIST血浆标准物质（NIST plasma SRM）和47名健康对照者（HC）以及47名帕金森病患者（PD）的血浆样本分别进行处理。在每个脂质类别中，至少添加一个内标（ISTD），用于定量分析。将混合物进行涡旋（1050 rpm）和离心（5000 g）以分离两个液相。上层有机相随后被氮气吹干，并储存在-20 °C。在分析前，将样本重新溶解在360 μL 90%甲醇中。

本研究采用了一种基于4D-TIMS的PRM-PASEF分析流程，用于常规临床血浆脂质组的定量分析。该流程的LC分离方法包括一个20分钟的梯度，流速为0.2 mL/min，使用C18 Luna Omega柱（100 × 2.1 mm × 1.6 μm）。对于负离子模式和正离子模式，分别注入20 μL和10 μL的样本。PRM-PASEF实验在负离子和正离子极性下进行，使用TIMS-TOF仪器（布鲁克达灵顿，德国）。基本的MS参数包括：端板偏移电压为500 V，负离子模式和正离子模式下的毛细管电压分别为4500 V和3600 V。扫描模式设置为PASEF，质荷比扫描范围为100–1350 Da。采集周期为0.1秒，正离子模式和负离子模式下的离子迁移率扫描范围分别为0.55–1.87 V.s/cm2和0.55–1.86 V.s/cm2。其他MS参数设置如下：MS间隔为10秒，质荷比隔离宽度为1 Da，保留时间范围为60秒，离子迁移率窗口为0.03 V.s/cm2。一个目标列表模板如图1所示。

为了评估sn2/sn1碎片峰面积比值与脂肪酰基链长度和不饱和度之间的变化，我们准备了PA、PC、PE、PG、PI和PS脂质的标准混合溶液，浓度为0.5 μg/mL。这些标准溶液的列表如补充数据2所示。从分子水平上，与前体离子标注顺序相同的酰基链称为SNA异构体（例如，PC 14:0/18:0），而其他sn位置异构体称为SNB异构体（例如，PC 18:0/14:0）。对于“SN回归模型”，我们使用了PC 32:0、PC 34:0、PC 34:1、PC 36:1、PE 34:1和PS 34:1的商业标准品，包括SNA和SNB异构体。我们准备了多种混合比例的PC标准品，包括1:1、1:2、1:4、1:8、2:1、4:1和8:1（SNA:SNB，体积比）。同样，为了估计不同脂肪酰基链的共洗脱异构体比例，我们使用了PC 36:2、PC 18:1/18:1和PC 18:0/18:2，以及PC 36:4、PC 16:0/20:4和PC 18:2/18:2的标准品。每种标准品的储备溶液浓度为1 mg/mL，随后根据不同的比例（1:1、2:1、4:1、8:1、1、1:2、1:4和1:8）制备标准混合溶液。

为了计算sn2/sn1比值，我们使用了PRM-PASEF获得的sn1和sn2脂肪酰基链碎片峰面积。对于共洗脱前体的sn异构体比值评估，我们计算了每个PC标准品的SNA:SNB混合物中的sn2/sn1碎片峰面积比值，并对每种类别下的所有标准品进行平均，以获得一个独立于脂肪酰基链长度和不饱和度的sn2/sn1碎片峰面积比值。该过程对所有准备的标准混合物重复进行。为了简化，我们将SNA:SNB比值转换为混合物中SNA异构体的比例。通过该比值的回归曲线和回归系数（如图1所示），可以计算出PLs混合物中SNA和SNB的丰度。对于大多数脂质类别，sn2 RCOO?碎片离子的丰度通常高于sn1 RCOO?碎片离子，但某些因素，如不饱和度和脂肪酰基链长度，会导致PLs的sn2/sn1碎片峰面积比值发生变化。为了评估这些变化，我们计算了纯标准品的sn2/sn1比值，如补充数据2所示。

对于大多数脂质类别，sn2 RCOO?碎片离子的丰度通常高于sn1 RCOO?碎片离子，但某些因素，如不饱和度和脂肪酰基链长度，会导致PLs的sn2/sn1碎片峰面积比值发生变化。为了评估这些变化，我们计算了纯标准品的sn2/sn1比值，如补充数据2所示。我们发现，对于sn1位置上的C14脂肪酰基链，该比值通常高于C16或C18脂肪酰基链，约为3。对于sn1位置上的C16或C18脂肪酰基链，该比值保持相对一致，约为2.1至2.6，特别是在PC类别中。对于sn2位置上的脂肪酰基链，该比值与脂肪酰基链长度的增加呈负相关。此外，这种相关性还强烈依赖于sn1位置上的碳原子数量。对于相同的碳原子数量和不饱和度，sn2/sn1比值会随着sn1位置上的碳原子数量增加而降低。由于缺乏标准品，我们只能评估sn2位置上的不饱和度对sn2/sn1比值的影响。结果发现，该比值与sn2位置上的不饱和度呈正相关，但相关性较弱（r2 = 0.35）。这些趋势在PS、PE和PG类别中也有所体现，无论sn2 RCOO?碎片离子的丰度如何。

我们进一步使用了sn位置异构体的碎片化模型，对PC、PE和PS类别中的sn异构体比例进行了预测。通过该模型，我们能够预测所有PC脂质的sn位置异构体比例，而无需对PRM-PASEF分析设置进行额外调整。因此，我们的工作流程可以可靠地用于量化具有不同脂肪酰基链长度的共洗脱异构体，以及sn位置异构体，从而扩展了复杂脂质组的定量覆盖能力。在NIST血浆标准物质中，我们通过PRM-PASEF和异构体模型对481种脂质进行了深度分析，其中包括68种PC、15种PE和93种TG共洗脱异构体。在32个NIST血浆标准物质复制品中，几乎70%的MS2定量脂质的CV值低于42%。对于CV值高于40%的脂质，发现有12个复制品为异常值。异常值是基于四分位数范围（IQR）和严格阈值0.1单位确定的。大多数异常值是低丰度分子，其碎片离子的强度预计会比高丰度分子更不稳定，从而导致MS2定量的低可重复性。此外，对于共享相同脂肪酰基链的等质量同位素脂质，也会出现较低的可重复性。例如，PC 17:0/20:4和PC O-18:0/20:4共享脂肪酰基链C20:4，这会成为两个等质量同位素的定量离子过渡，也由于其较高的丰度。此外，它们在安排的保留时间窗口中存在部分重叠（例如，PE 16:0/22:6和PC 17:0/14:1）。这些因素可能导致对等质量同位素前体的定量离子过渡提取不准确。每个特征的平均定量值（n = 32）如补充数据3所示。

在NIST血浆标准物质中，89%的识别PC含有SNB位置异构体。如上所述，该模型预测的sn位置异构体比值的准确性为±20%；因此，预测SNA异构体含量超过100%的脂质物种被视为异构体纯的。同样，“SN回归模型”在PE类别中预测了12种位置异构体。通过比较MS1和MS2定量，我们发现MS2的归一化值与MS1的归一化值之间的比值在0.7到1.3之间。然而，某些脂质在两种定量方法之间的值存在较大差异。例如，PC 17:0/18:2和其共洗脱异构体PC 17:1/18:1各含有其他sn位置异构体的显著百分比（即PC 18:2/17:0（17%）和PC 18:1/17:1（45%））。这些差异可能源于前体碎片化效率或共洗脱异构体的存在等因素。由于MS2定量方法对每个异构体进行单独分析，因此其定量值预计会与MS1前体离子定量值不同。

此外，使用BioPAN软件对MS1定量结果进行的生化通路分析仅基于脂质物种水平，包括异构体簇。而MS2定量方法则提供了脂质物种在sn位置水平和脂肪酰基含量水平的信息。这使得我们能够更深入地理解这些通路在特定脂肪酰基水平上的变化。例如，从MS1数据中推断出LPC 14:0到PC 32:2的生化转化。而PC 32:2的脂肪酰基含量和sn构型只能通过MS2进行确定。因此，通过MS2碎片离子（如本研究中采用的PRM-PASEF和组成/构型异构体模型）可以实现对PC 32:2的共洗脱脂肪酰基异构体的单独定量。这使得PC 32:2到LPC 14:0的转化能够被明确证明，前提是MS2数据能显示PC 32:2簇中的饱和油酸FA异构体。因此，仅基于MS1数据，由脂质转化软件工具分配的这种脂质转化可能不明确和/或不准确。同样，LPC 16:1到PC 32:2的转化只能通过MS2定量方法进行准确识别，前提是PC 32:2簇中的共洗脱PC 16:1/16:1异构体可以被MS2方法定量。由于sn位置注释的特异性，PLA2在PD中的酶促作用可以更精确地阐明，并与脂肪酰基代谢相关联，而不是仅使用脂质类别或总组成。准确估计特定脂肪酰基组成的LPC/PC比值，可以提供更准确的脂肪酰基特异性通路和重塑信息，从而推断特定疾病条件下可能的酶促底物特异性。LPC/PC比值有助于区分帕金森病患者与健康对照者，并且可以用于更好地调整脂质的诊断浓度范围，以适应女性和男性患者的需求。

通过比较两组之间的反应，z-score值解释了HC和PD之间的脂质代谢差异。通过MS2方法，可以将特定的脂质反应与脂肪酰基含量联系起来，而不是使用通常基于MS1定量的（子）类别转化，这与脂肪酰基含量无关。这种方法为疾病影响的通路提供了新的信息。使用Reactome进行的功能通路分析表明，与帕金森病相关的一些潜在通路，如血浆脂蛋白组装、阿片信号传导、G蛋白介导的事件等，仅能通过PRM-PASEF工作流程识别。同时，有68条通路可以通过两种方法共同揭示。这些通路可以用于更好地优先选择酶促靶点和底物，以便后续验证和治疗设计，而不是仅依赖于基于脂质类别的通路分析，这会导致在使用MS1扫描定量时，将异构体簇合并为脂质总组成。

在结论部分，我们将PRM-PASEF与SN回归模型结合，提高了对脂肪酰基组成异构体和sn位置异构体的定量能力，扩展了临床分析中的脂质组覆盖范围。这对于区分脂质异构体的功能作用至关重要，因为当前软件通常将功能分配给更广泛的脂质类别，而忽略了异构体的细节。该方法适用于各种生物样本类型和条件，涉及脂质代谢。在帕金森病中，我们观察到PC、LPC和TG的失调，这与已知的酶促和炎症变化相一致。TG的组成异构体在区分PD与HC中发挥了重要作用，强调了脂肪酰基代谢的重要性。此外，PD中的脂质变化还与免疫信号传导（如Toll样受体、钙信号）、神经变性以及内质网-高尔基功能相关。值得注意的是，脂质组学分析揭示了PD中与正常衰老不同的性别和年龄特异性模式，表明了疾病特异性通路的存在。总之，结合PRM-PASEF和异构体建模的方法，为脂质功能和病理提供了更深入的见解，推动了生物标志物的发现和疾病机制的研究。