无膜环境中膜蛋白-蛋白相互作用的实时结合动力学

《Analytical Chemistry》：Real-Time Binding Kinetics of Membrane Protein–Protein Interactions in a Membraneless Setting

高分辨率生物层干涉法直接评估膜蛋白受体与蛋白配体预平衡结合动力学，无需构建脂质复合体。通过融合可编程抗体模拟物（如ZEGFR/ZHER2/ZHER3/Adnectin1）至 truncated FhuA膜蛋白的N端，构建水溶性的合成膜蛋白复合体。实验证明，该体系在表面等离子体共振验证下具有高亲和力结合特性（KD 16±3 nm），结合/解离速率常数分别为10^4 M?1s?1和10^-4 s?1量级。方法避免了传统脂质体系（如脂质纳米盘）的蛋白重构和纯化步骤，通过单链设计实现稳定膜蛋白结构，且适用于复杂生物样本的高通量检测。

　　在现代生物医学研究和药物开发中，膜蛋白与配体之间的相互作用分析是一项具有重要意义的任务。膜蛋白在细胞膜上发挥着关键作用，例如离子和代谢物的运输、受体与配体的识别、酶促反应、细胞信号传递以及细胞间通讯等。由于膜蛋白在自然状态下通常嵌入在细胞膜中，研究其与配体的相互作用需要将这些蛋白从原始膜或表达系统中提取出来，并重新整合到合成膜系统中，如支持脂质双分子层、脂质体或脂质纳米盘等。然而，这一过程通常涉及多个复杂的步骤，包括蛋白溶解、复性以及功能重建，不仅增加了实验难度，还可能导致蛋白活性的丧失。因此，寻找一种更为简便、高效且无需依赖膜结构的分析方法，成为当前研究的热点。

本文提出了一种基于生物层干涉技术（Biolayer Interferometry, BLI）的新方法，用于在无标签、无膜的条件下直接评估膜蛋白受体与配体之间的预平衡结合动力学。与传统方法相比，该方法避免了将膜蛋白转移到膜系统中，从而减少了实验成本和优化时间。此外，这种方法也不需要将蛋白固定在传感器表面，使得实验流程更加简化。实验中，将目标配体通过化学方法固定在传感器表面，而膜蛋白则以溶解在去垢剂中的形式在溶液中与之相互作用。通过实时监测传感器响应的变化，可以准确获取结合和解离阶段的动力学参数，从而评估膜蛋白与配体之间的结合特性。

为了验证这一方法的可行性，我们选择了一组合成膜蛋白作为测试对象。这些合成膜蛋白在N端融合了一种可编程的抗体模拟结合域，该结合域能够特异性识别某一配体。这些结合域与膜蛋白融合后，形成的蛋白在溶液中表现出对固定在传感器表面的配体的高亲和力。为了进一步确认这些结合动力学的准确性，我们还使用了表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）技术，对结合域与配体之间的相互作用进行了测量。SPR技术与BLI技术在原理上具有相似之处，但其在处理复杂生物样本和高通量数据采集方面更具优势。通过这两种技术的相互验证，我们发现BLI方法在分析膜蛋白与配体之间的结合特性时，能够提供高信噪比的实时数据，从而提高实验的可靠性。

为了实现这一方法，我们首先设计了包含结合域的膜蛋白。这些蛋白由细菌外膜蛋白茎（如大肠杆菌FhuA的β桶结构）和一个可编程的结合域组成，通过一个柔性的六肽连接子连接在一起。通过基因工程手段，我们构建了多种不同的结合域与膜蛋白的融合形式，包括ZEGFR、ZHER2、ZHER3、Adnectin1等。这些蛋白在表达和纯化过程中，经过一系列优化步骤，最终以高纯度形式获得。为了确保蛋白的正确折叠和结构稳定性，我们还使用了圆二色光谱（Circular Dichroism, CD）技术，通过测量远紫外区域的光谱变化，确认了蛋白的β桶结构是否形成。CD结果表明，这些蛋白在低尿素浓度下能够稳定地保持其结构，而不会发生显著的构象变化。

在BLI实验中，我们将这些合成膜蛋白以不同浓度（从低纳摩尔到高纳摩尔）加入到含有配体的溶液中。通过监测传感器响应的变化，我们能够确定结合和解离阶段的动力学参数。实验结果显示，结合域与配体之间的结合速率常数（k_on）和解离速率常数（k_off）均处于可接受的范围内，表明这些蛋白在无膜状态下仍能保持其功能活性。此外，我们还发现不同结合域与配体之间的结合亲和力存在显著差异，例如EGFR与ZEGFR-tFhuA之间的结合亲和力较高，而TGFα-tFhuA则表现出最低的结合亲和力。这说明结合域的结构设计和配体的结合特异性对实验结果具有重要影响。

为了进一步验证BLI方法的准确性，我们还使用了SPR技术对相同的结合域与配体相互作用进行了测量。SPR技术能够提供与BLI技术相似的动力学数据，但由于其对膜蛋白的处理方式不同，实验结果存在一定的差异。例如，在SPR实验中，当结合域在溶液中自由扩散时，其与配体之间的结合亲和力显著高于BLI实验中的结果。这一现象主要归因于结合域在溶液中的扩散系数较高，从而提高了结合速率。此外，SPR技术在处理含有膜蛋白的样品时，可能会遇到微流体系统堵塞和非特异性吸附的问题，这在一定程度上影响了实验的准确性。

通过这两种技术的对比，我们发现BLI方法在分析膜蛋白与配体之间的结合动力学时，具有较高的灵敏度和简便的操作流程。这种方法不仅能够减少实验成本，还能提高实验的通量，使得大规模的样品筛选成为可能。此外，BLI方法在处理复杂的生物样品时，能够保持较高的信噪比，从而提高了实验的可靠性。相比之下，SPR技术虽然在某些方面具有优势，但在处理含有膜蛋白的样品时，存在一定的局限性。

综上所述，本文提出了一种基于BLI技术的新型方法，用于在无标签、无膜的条件下评估膜蛋白与配体之间的结合动力学。该方法避免了将膜蛋白转移到膜系统中的复杂步骤，从而提高了实验的效率和准确性。通过结合域与配体的特异性相互作用，我们能够获取结合和解离阶段的实时数据，并通过多种验证手段（如CD光谱和SPR技术）确认实验结果的可靠性。这种方法不仅适用于高通量数据采集，还能够处理复杂的生物样品，为未来的膜蛋白研究提供了新的思路和技术手段。