基于工程化纳米体的夹心竞争免疫测定法显著扩展了黄曲霉素B1的检测范围

《Analytical Chemistry》：Engineered Nanobodies-Based Sandwich-Competitive Immunoassay Broadens the Detection Range for Aflatoxin B1

竞争性免疫分析在检测小分子半抗原时存在灵敏度不足和检测范围狭窄的问题。本研究通过基因工程优化纳米抗体并开发新型夹心竞争免疫分析（SCI）技术，以黄曲霉毒素B1为模型，建立无需洗脱的体外进化策略筛选高活性突变体，其中最优突变体IC50降低至原始体的1/3.5。SCI技术通过双抗体夹心竞争机制实现IC10-IC90宽泛检测范围，线性R2>0.98，较传统方法在IC20-IC80范围外性能显著提升（R2<0.92），并经加标回收实验验证实际检测有效性。

　　

针对小分子配体（如黄曲霉素B₁ (AFB₁) 的竞争性免疫测定方法通常受到灵敏度不足和动态范围狭窄的限制。本研究通过纳米抗体的基因工程改造以及以AFB₁ 为模型的新型免疫测定方法的开发来解决这些问题。研究人员开发了一种创新的无需洗脱的生物淘选策略，用于体外筛选针对AFB₁的纳米抗体，该策略被证明非常适合筛选高性能的抗配体纳米抗体。利用这一策略，获得了几种分析性能得到提升的突变体，其中一种突变体的半数抑制浓度（IC₅₀）比亲本纳米抗体降低了3.5倍。五种代表性突变体的亲和动力学研究表明，IC₅₀值与其对人工抗原的亲和力之间存在正相关关系。基于这些突变体，研究人员构建了一种新型夹心竞争性免疫测定（SCI）方法，该方法使用了两种纳米抗体和一种特殊的人工抗原。实验结果显示，SCI方法的检测范围（IC₁₀–IC₉₀）显著拓宽，且线性度非常好（R² > 0.98），优于传统竞争性测定方法（在IC₂₀–IC₈₀范围内线性度较差，R² < 0.92）。SCI方法更宽的检测范围归因于分析物与夹心免疫复合物之间的两阶段竞争结合过程。加标回收实验验证了SCI方法在实际样品检测中的准确性和适用性。本研究为针对配体的纳米抗体的体外进化提供了一种新策略，并推动了这类分子的免疫测定技术的发展。