开发一种能够结合间皮素的工程化支架蛋白，作为治疗胸膜间皮瘤的诊疗工具

《Bioconjugate Chemistry》：Development of a Mesothelin-Binding Engineered Scaffold Protein as a Theranostic for Pleural Mesothelioma

MSLN靶向蛋白Fn3 5.3.2通过定向进化优化后，结合DOTAGA-Ga69形成高特异性诊断治疗复合物，证实其具有纳摩尔级结合亲和力、膜表面结合及快速内吞特性，为恶性胸膜间皮瘤提供了新型分子影像与靶向放疗工具。

　　Mesothelin (MSLN) 是一种在多种肿瘤中高表达的生物标志物，其在健康组织中的表达水平极低。由于其在细胞膜上的特异性定位和广泛的肿瘤相关性，MSLN 成为靶向治疗中的一个极具潜力的分子。特别是在胸膜间皮瘤（Pleural Mesothelioma, PM）这一致命性癌症中，MSLN 的表达对于诊断和治疗具有重要意义。PM 主要与石棉暴露相关，其诊断往往发生在疾病晚期，因为早期阶段缺乏明显的临床症状。此外，PM 对现有治疗方法的耐药性较高，手术仅适用于部分患者，导致患者预后较差，中位生存期仅为 8 至 14 个月。因此，开发针对 MSLN 的诊断和治疗策略成为当前研究的重点。

在过去的几十年中，研究人员尝试通过测量 MSLN 血清水平和开发针对 MSLN 的靶向疗法来应对 PM 的挑战。然而，尽管抗体-药物偶联物（ADCs）在其他癌症中显示出一定的疗效，但在 PM 中的应用尚未取得显著成果。例如，一项针对 MSLN 靶向 ADC（Anetumab Ravtansine）的 II 期临床试验并未显示出优于化疗药物（如 Vinorelbine）的效果，尽管该 ADC 具有良好的安全性。此外，针对 MSLN 的 CAR T 细胞疗法也面临类似的挑战，其中 MSLN 在细胞表面的脱落被认为是影响治疗效果的关键因素之一。抗体和 CAR T 细胞需要长时间与肿瘤细胞表面的靶点结合，而 MSLN 的脱落可能限制了其在体内的作用。因此，开发一种能够在 MSLN 脱落之前与之结合的靶向分子成为一种可能的解决方案。

在这一背景下，研究者开发了一种基于非抗体结构的蛋白质支架——纤维连接蛋白 III（Fn3）蛋白，用于构建针对 MSLN 的新型靶向分子。Fn3 蛋白因其较小的体积、良好的组织分布特性以及易于工程改造的潜力，被认为是抗体替代品的一种理想选择。通过酵母表面展示（YSD）和定向进化技术，研究团队成功地设计出具有高亲和力和特异性的 Fn3 蛋白变体，这些变体能够特异性地结合 MSLN。与传统抗体相比，Fn3 蛋白的特性使其在分子成像和靶向放射治疗中表现出更好的应用前景，尤其是在克服抗体在体内的长期循环所带来的剂量限制性毒性方面。

在进一步的研究中，研究团队将 MSLN 靶向 Fn3 蛋白与一种名为 DOTAGA 的放射性金属螯合剂结合。DOTAGA 是一种由 1,4,7,10-四氮杂环十二烷、1-（戊二酸）-4,7,10-三乙酸组成的多臂螯合剂，能够与放射性金属离子（如 Ga-68 和 Ga-69）形成稳定的配合物。通过将 Fn3 蛋白的 C 末端进行半胱氨酸（Cys）替换，研究团队实现了对 DOTAGA 的位点特异性偶联。这一策略避免了 N 末端修饰可能带来的空间位阻问题，从而提高了偶联效率和结合特异性。通过电喷雾电离质谱（ESI-MS）分析，研究团队确认了 Fn3-DOTAGA 的偶联比例接近 1:1，表明其具有较高的化学稳定性。

为了评估 Fn3-DOTAGA 与 MSLN 的结合能力，研究团队使用了 MSLN 高表达的 MSTO-211H 细胞系进行实验。通过流式细胞术和平衡结合实验，他们发现 Fn3-DOTAGA 与 MSLN 的结合亲和力（解离常数 K_D）接近 31 nM，而与未偶联的 Fn3 相比，其结合能力略有下降，这可能是由于螯合剂的引入增加了蛋白质的灵活性，从而影响了结合稳定性。然而，当 Fn3-DOTAGA 与 Ga-69 进行偶联后，其 K_D 重新恢复至约 15 nM，表明金属螯合可能有助于提高结合的特异性。

研究团队进一步利用共聚焦显微镜观察了 Fn3 与 MSLN 的共定位和内化情况。实验结果显示，Fn3 能够与 MSLN 在细胞膜上形成共定位，并在与细胞结合后迅速内化至细胞内部。这一特性对于分子成像和靶向放射治疗具有重要意义，因为内化能力有助于药物或放射性物质在肿瘤细胞内部发挥作用，从而提高治疗效果。相比之下，传统的 MSLN 靶向抗体在细胞膜上的结合较为稳定，但缺乏内化能力，这可能限制了其在某些治疗场景中的应用。而 Fn3 的内化特性则为其在放射治疗中的应用提供了新的思路。

此外，研究团队还评估了 Fn3-DOTAGA-⁶⁹Ga 在不同条件下的稳定性。通过热变性实验（Thermal Shift Assay），他们发现该分子在 pH 4.5 和不同温度条件下的热稳定性较好，能够在较低的温度下保持结构完整性，从而适应放射性金属螯合所需的反应条件。这一结果表明，Fn3-DOTAGA-⁶⁹Ga 在体内的应用具有较高的可行性，能够有效避免因热不稳定而导致的分子失活问题。

在实际应用方面，研究团队将 Fn3-DOTAGA-⁶⁹Ga 用于分子成像和靶向放射治疗的初步验证。通过在 PM 细胞系中进行结合实验，他们确认了该分子能够特异性地结合 MSLN 阳性细胞，并且在体内可能具有良好的靶向性和信号强度。这些特性使得 Fn3-DOTAGA-⁶⁹Ga 成为一种具有潜力的新型诊断和治疗分子，尤其适用于 PM 和其他 MSLN 阳性肿瘤。

在实验过程中，研究团队采用了多种技术手段，包括酵母表面展示、流式细胞术、共聚焦显微镜和热变性实验等，以全面评估 Fn3-DOTAGA-⁶⁹Ga 的结合能力、稳定性以及在细胞内的行为。这些实验不仅验证了该分子的靶向特性，还为其在临床前模型中的进一步研究奠定了基础。通过优化偶联条件和评估其在不同环境下的表现，研究团队为该分子的潜在应用提供了充分的科学依据。

总之，这项研究展示了 Fn3 蛋白作为非抗体靶向分子在癌症治疗和诊断中的应用潜力。通过结合 DOTAGA 螯合剂和放射性金属 Ga-69，研究团队开发了一种新型的 MSLN 靶向分子，具有高亲和力、特异性以及良好的内化能力。这一成果为 PM 和其他 MSLN 阳性肿瘤的早期诊断和靶向治疗提供了新的思路，同时也为未来开发更高效的分子成像和放射治疗策略打下了坚实的基础。随着进一步的研究和临床试验的推进，这种新型分子有望成为癌症治疗领域的一项重要突破。