PEG化作用驱动PLGA纳米颗粒表面蛋白质层的重构：对巨噬细胞识别机制的影响

《Biomacromolecules》：PEGylation-Driven Remodeling of the Protein Corona on PLGA Nanoparticles: Implications for Macrophage Recognition

该研究系统探究了不同PEG-PLGA纳米颗粒（PEG30、PEG50、PEG70）表面化学特性与蛋白质外壳（PC）组成对巨噬细胞摄取的影响。通过优化微滤分离方法，结合蛋白组学分析发现，PEG表面密度虽接近理论值，但PC蛋白组成差异显著：高PEG含量颗粒（PEG70）因补体因子B和α-S1-球蛋白富集，反而表现出更强的巨噬细胞摄取能力，而抗凝血酶III和Apo-A1的减少可能部分抵消这种效应。流式细胞术和共聚焦显微观察证实，PC中opsonin/dysopsonin平衡比单一蛋白相互作用更能调控纳米颗粒的免疫识别与胞内摄取。研究强调，纳米载体的性能优化需综合考虑表面化学设计、PC动态组成及其与靶细胞互作的多因素关联。

　　纳米颗粒（NPs）在生物体液中与生物大分子相互作用，形成一个动态的生物分子层，称为蛋白质冠（Protein Corona, PC）。这种冠层不仅决定了纳米颗粒的生物识别特征，还深刻影响其与免疫系统的相互作用。本研究重点探讨了PLGA和PEG-PLGA纳米颗粒在细胞培养液中形成的蛋白质冠的组成及其对骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）摄取行为的影响。研究发现，尽管纳米颗粒的尺寸存在差异，但实际暴露在表面的PEG量却接近，且显著低于理论值。通过标准化的微滤法分离出的蛋白质冠呈现出与PEG密度相关的不同蛋白吸附模式，进一步揭示了PEG表面密度在调控蛋白质冠组成中的关键作用。研究还发现，PEG表面密度与巨噬细胞摄取之间存在显著的负相关关系，支持了“调理素/反调理素平衡”比单一蛋白相互作用更为重要的假设。这些发现强调了在预测和调控纳米载体性能时，必须进行严格的表面表征和蛋白质冠分析。

在纳米医学领域，纳米颗粒与巨噬细胞的相互作用具有双重意义。一方面，这种相互作用构成了一个重要的生物屏障，导致纳米载体在循环系统中迅速被识别、吞噬和清除；另一方面，它也为利用巨噬细胞作为治疗靶点提供了机会，尤其是在炎症、感染或肿瘤相关微环境中。纳米颗粒的理化性质，如尺寸、表面电荷和表面化学组成，是决定吸附蛋白的种类、数量和构象的关键因素，这些统称为“蛋白质冠指纹”。对纳米颗粒的化学身份（即其固有材料特性）与生物身份（即蛋白质冠组成）之间的关系进行深入理解，是设计具有特定免疫识别特征和可控药代动力学的新型纳米系统的基础。

在各种生物可降解纳米载体中，两亲性聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PEG-PLGA）纳米颗粒是一个典型的例子，其表面化学特性对生物相互作用具有决定性影响。这类纳米颗粒通过在表面形成亲水的PEG冠，提高了其在体内的胶体稳定性，并延长了循环时间。即使在体外条件下，如与胎牛血清（FBS）孵育，纳米颗粒也会通过蛋白吸附获得新的“生物身份”，进而影响其细胞摄取、运输和毒性等生物学行为。因此，对纳米颗粒表面化学特性的准确表征对于理解其在生物环境中的行为至关重要。

然而，目前PEG表面密度的量化并不常见，这使得纳米颗粒表面化学、蛋白质冠组成与生物学效应之间的关系难以明确。值得注意的是，只有少数研究系统地探讨了不同PEG化程度对PEG-PLGA纳米颗粒蛋白质冠的影响及其与免疫识别和细胞摄取的相关性。此外，一个常见的假设认为PEG完全且均匀地暴露在纳米颗粒表面，但这一假设在多项研究中已被数据反驳。因此，迫切需要一种能够保持蛋白质冠原生结构和组成的隔离方法，以确保对纳米颗粒生物学行为的准确评估。

本研究中，我们开发并系统地表征了一系列具有不同PEG含量的PEG-PLGA纳米颗粒，特别关注其表面理化特性。随后，我们比较了三种不同的蛋白质冠隔离方法，即离心-再悬浮法、尺寸排阻色谱法（SEC）和微滤法，并确定了最适合在FBS环境中回收蛋白质冠的方法。蛋白质组学分析表明，不同配方的纳米颗粒在蛋白质冠中具有共同和特异的蛋白签名，其中包括参与免疫识别的蛋白。最后，我们研究了这些蛋白质冠指纹对纳米颗粒在小鼠来源巨噬细胞中摄取的影响，建立了PEG化程度、生物身份和细胞相互作用之间的明确联系。

为了优化蛋白质冠的分离过程，我们以负载了荧光探针DiI的PLGA纳米颗粒作为参考样本，因为它们已被证明容易在表面吸附蛋白质。通过离心-再悬浮、尺寸排阻色谱和微滤三种方法对纳米颗粒进行了处理，结果表明，微滤法是最可靠的方法，能够保持纳米颗粒与蛋白质冠的完整性和稳定性。在微滤法中，纳米颗粒与FBS孵育后，通过一系列洗涤和浓缩步骤，成功回收了表面吸附的蛋白质。这种方法不仅提高了蛋白质回收率，还确保了纳米颗粒的完整性，为后续的蛋白质组学分析提供了高质量的样本。

在蛋白质组学分析中，我们利用纳米液相色谱-质谱联用技术（nanoLC-MS/MS）对蛋白质冠进行了详细研究。通过优化的FASP（滤膜辅助样品制备）流程，我们能够识别并定量不同纳米颗粒配方的蛋白质冠。研究结果表明，不同PEG化程度的纳米颗粒在蛋白质冠中表现出不同的蛋白组成和相对丰度。尽管所有纳米颗粒的蛋白质冠在总体上存在一定的相似性，但具体的蛋白种类和数量在不同配方之间存在显著差异。这些差异反映了PEG化对纳米颗粒表面蛋白吸附的调控作用，而不是简单的屏蔽效应。

基因本体分析进一步揭示了这些蛋白质冠在生物过程中的功能分布。所有纳米颗粒的蛋白质冠中都包含了参与血液凝固、补体激活和细胞粘附等过程的蛋白，但其相对丰度因PEG化程度而异。例如，补体因子C3在所有配方中均被检测到，但补体因子C4、C5a和H在PEG30和PEG50中的丰度高于PEG70。相反，补体因子B在PEG70中的富集程度更高。这些结果表明，PEG化不仅影响了纳米颗粒的表面特性，还显著改变了其与生物分子的相互作用模式。

进一步研究了纳米颗粒的细胞摄取行为，发现PEG70纳米颗粒在较短时间内表现出更高的摄取率和更大的摄取量，这与它们较低的蛋白结合量形成了鲜明对比。这一现象表明，蛋白质冠的组成和特性在调控巨噬细胞对纳米颗粒的识别和摄取中起着更为关键的作用。此外，研究还发现，脂多糖（LPS）刺激并未显著改变纳米颗粒的摄取模式，说明这些差异源于纳米颗粒与蛋白之间的相互作用，而非巨噬细胞的激活状态。

本研究的结果具有重要的意义，特别是在纳米医学和生物技术领域。首先，它强调了在纳米颗粒设计过程中，除了关注其表面化学特性外，还需要全面分析其形成的蛋白质冠，以更准确地预测其生物学行为。其次，研究结果表明，纳米颗粒的表面设计并不能单独决定其生物行为，蛋白质冠的形成和组成才是影响其在生物系统中命运的关键因素。因此，深入理解蛋白质冠的形成机制及其对纳米颗粒行为的影响，对于优化纳米载体的性能、提高其在体内的治疗效果和降低其潜在毒性具有重要意义。

此外，本研究还指出了当前在蛋白质冠研究中存在的一些方法学局限性。例如，传统的离心-再悬浮法可能会破坏纳米颗粒与蛋白质之间的天然结合状态，从而导致蛋白质冠的结构失真和分析偏差。尺寸排阻色谱法虽然能够分离纳米颗粒与背景蛋白，但其样本稀释过程可能导致蛋白质的损失。相比之下，微滤法在保持蛋白质冠原生结构和组成方面表现出更高的可靠性和可重复性，为未来的研究提供了更优的实验方案。

总的来说，本研究通过系统的实验设计和先进的分析技术，揭示了PEG化对纳米颗粒蛋白质冠组成和巨噬细胞摄取行为的复杂影响。研究结果不仅有助于更深入地理解纳米颗粒在生物系统中的行为，还为开发具有特定免疫识别特征和可控药代动力学的新型纳米载体提供了理论依据和技术支持。未来的研究应进一步探索人类血清中蛋白质冠的组成和功能，以更好地模拟体内环境并指导临床应用。