肺形菇（Pleurotus pulmonarius）分泌组的基因组学、蛋白质组学和生化研究及其在生物质糖化中的作用

《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：Genomic, Proteomic, and Biochemical Study of Pleurotus pulmonarius Secretome and Its Role in Biomass Saccharification

平菇（Pleurotus pulmonarius）基因组解析及其木质纤维素分解潜力研究，通过蛋白质组学和生化分析发现：该真菌对不同底物（山毛榉木屑、玉米秸秆、木糖）诱导的酶分泌谱差异显著。玉米秸秆培养产生更高效的纤维素和半纤维素降解酶，尤其在抑制氧化还原酶（如添加NaN?）后，协同工业纤维素酶实现糖释放提升40%。研究揭示了其基因组包含566个碳水解酶（CAZymes），但实际酶活性受底物诱导调控，且存在大量未知功能蛋白（占30.47%）。该成果为定制化生物酶制剂开发及农业残余物资源化利用提供了新思路。

　　植物生物质是地球上最丰富的生物基碳来源之一，占估计的550亿吨中约80%。这些生物质主要由植物细胞壁组成，其中包含纤维素、木质素、半纤维素以及果胶等生物聚合物。木质纤维素生物质（LCB）因其在降解和糖化方面的顽固性而成为利用生物基资源进行工业转化的重要挑战。木质素作为植物细胞壁的关键组成部分，是一种复杂的芳香族聚合物，与半纤维素交联，对细胞壁的结构完整性、防水性和酶接触多糖基质的障碍起着重要作用。因此，开发高效的降解策略对于实现从石油基资源向生物基资源的过渡至关重要。

在自然环境中，木质素的降解主要依赖于白腐真菌（WRF），这类真菌属于Agaricomycotina亚纲。它们能够分泌一组包括水解酶（如纤维素酶和半纤维素酶）和氧化酶（如木质素降解酶和辅助酶）在内的酶混合物，以及非催化性的碳水化合物结合模块（CBMs）。这些蛋白质协同作用，实现了对木质纤维素所有成分的高效降解。碳水化合物活性酶（CAZymes）是这类酶的核心，其分类和功能注释依赖于CAZy数据库，而dbCAN则是一种基于隐藏马尔可夫模型（HMMs）的自动化注释工具，用于CAZyme的识别、亚家族分类和酶分类编号（EC）分配。这些工具为深入研究真菌的降解能力提供了重要的技术支持。

在本研究中，我们重点分析了Pleurotus pulmonarius LGAM 28684菌株的基因组及其在木质纤维素降解中的生物催化潜力。该菌株先前已被研究用于高漆酶产量和处理富含酚类的橄榄油废水。通过高通量质谱分析（LC-MS/MS）和生化实验，我们揭示了该菌株在不同木质纤维素底物上分泌的酶谱特性，以及其在生物质转化中的应用潜力。研究结果显示，该菌株在不同底物上的分泌模式具有显著差异，反映了其对底物特异性适应的酶响应机制。

Pleurotus pulmonarius属于白腐真菌，其在农业、生物修复和食品工业中具有广泛应用。该属的真菌能够利用广泛的木质纤维素底物，包括木质和非木质生物质。这种灵活性为利用农业工业残渣进行可持续的食品、生物活性化合物和生物材料生产提供了机会。随着高分辨率、高通量的质谱技术的发展，研究人员能够全面分析真菌的分泌蛋白，揭示其存在、丰度和翻译后修饰（PTMs）等信息。然而，目前关于Pleurotus物种的质谱数据仍然有限，主要集中在P. ostreatus和P. eryngii上。因此，对P. pulmonarius的深入研究不仅有助于理解其生物催化特性，还为设计工业用酶混合物提供了新的视角。

为了全面分析P. pulmonarius的生物催化潜力，我们对其基因组进行了测序、组装和注释。通过Illumina NovaSeq X Plus平台，我们获得了约5.14 Gb的DNA数据。使用GenomeScope进行k-mer分析，我们估计了该基因组的杂合度为2.32%，并观察到了代表杂合和纯合区域的两个明显峰值。最终的基因组组装由Redundans管道完成，该管道特别适用于杂合基因组。最终的基因组包含2,651条scaffold，总长度为41.1 Mb，但由于短读技术的限制，其碎片化程度较高。通过BRAKER3管道进行结构注释，结合另一个P. pulmonarius菌株的RNAseq数据和OrthoDB v11中的真菌蛋白，我们预测了14,485个蛋白编码基因，编码15,491个蛋白质，包括异构体。其中，94.9%的基因具有完整的起始和终止密码子，而30.47%的基因编码功能未知的蛋白质，这表明Pleurotus属的蛋白质功能仍需进一步研究。

为了评估P. pulmonarius在木质纤维素降解中的潜力，我们优先注释了CAZymes。我们使用了dbCAN管道，并用Mycocosm数据库中的更新版真菌CAZymes替换其默认的CAZy FASTA文件。dbCAN整合了三个数据库，并建议使用至少两个数据库支持的蛋白质进行自动基因组注释。为了提高真阳性率，我们对单数据库匹配的蛋白质进行了人工复核。最终，我们保留了8个dbCAN HMM-only和15个dbCAN_sub-only的匹配结果。相比之下，DIAMOND-only的匹配结果具有较高的假阳性率，其中209个候选蛋白中仅有22个在人工复核后被保留，大部分被错误分类为糖苷水解酶（GH）和糖苷转移酶（GT）。通过引入人工复核的单数据库匹配，CAZymes的注释数量增加了8.01%，而82.69%的CAZymes在所有三个数据库中均有支持，这表明我们对CAZymes的注释具有较高的准确性和全面性。

为了澄清P. pulmonarius LGAM 28684的分类，我们使用了40个核单拷贝基因进行系统发育分析，比较了66个Pleurotus菌株和两个Hohenbuehelia菌株的序列。我们从GenBank中获取了P. ostreatus物种复合体的序列数据，并将其作为BLAST查询，以识别所有基因组中的同源区域。LGAM 28684与三个意大利的P. pulmonarius菌株形成一个高度支持的分支，与法国的Pleurotus sp. 7菌株形成姐妹分支。这一结果有助于明确P. pulmonarius LGAM 28684的分类地位，并揭示了该属的系统发育多样性。

在本研究中，我们还进行了Pleurotus属所有可用蛋白组的比较分析，以探讨其在木质纤维素降解中的普遍性。对于没有注释基因组的物种，我们使用GeneMark-ES v4.71进行基因预测，该工具经过优化，适用于真菌基因组。通过BUSCO分析，我们发现预测的蛋白组具有最高的完整性（98.3%），这表明我们的注释策略具有较高的灵敏度。相比之下，P. eryngii和P. ostreatus PC9的完整性分别为97.5%和96.3%。这些结果不仅展示了Pleurotus属在木质纤维素降解中的广泛潜力，还为后续的蛋白组分析和功能研究提供了基础。

我们还对P. pulmonarius在不同木质纤维素底物上的分泌蛋白进行了分析，包括桦木、玉米秸秆和木糖。通过生物三重重复的无标签LC-MS/MS质谱分析，我们获得了520,137个MS/MS光谱，并成功将其中42.25%的光谱匹配到参考蛋白数据库，这在常规的质谱实验中是一个显著的识别率。其中，10.5%的匹配光谱与常见污染蛋白（如角蛋白和胰蛋白酶）相关。为了提高识别的准确性，我们在玉米秸秆样本中加入了71个玉米蛋白，以排除可能的干扰。最终，我们可靠地量化了1,734个蛋白质，其中96.71%至少有两个定量的肽形式，90.12%有两个唯一的肽。通过亚细胞定位分析，我们发现37.44%的量化蛋白质是细胞外分泌的，而11.84%被认为是膜结合的。

在CAZyme的分泌谱分析中，我们发现桦木诱导了最多的差异性富集蛋白质，而玉米秸秆和木糖则诱导了不同的酶谱。虽然木糖与玉米秸秆之间的差异性富集蛋白数量较少，但在CAZyme层面，玉米秸秆诱导了43个显著富集的CAZyme，而木糖诱导了17个相反的模式。这表明CAZyme在底物变化中的敏感性较高，而非CAZyme蛋白则表现出更广泛的表达模式。这种差异性可能反映了CAZyme在木质纤维素降解中的高度特异性，而非CAZyme蛋白则可能在更广泛的生理过程中发挥作用。

通过结合生化实验和质谱数据，我们进一步揭示了P. pulmonarius在不同木质纤维素底物上的降解能力。玉米秸秆的分泌物表现出最高的多糖降解活性，而桦木分泌物则富含漆酶。这些结果与我们之前的发现一致，表明该菌株能够分泌多种漆酶，用于木质素的降解。此外，我们还发现玉米秸秆分泌物在某些条件下表现出更高的降解效率，这可能与其诱导的多糖降解酶有关。这些酶在玉米秸秆的诱导下表现出更高的活性，而在其他底物上则相对较低。

我们还分析了P. pulmonarius在木质纤维素降解中的氧化酶活性。虽然在生化实验中未检测到过氧化物酶活性，但在质谱分析中我们发现了多种过氧化物酶。这些过氧化物酶可能在某些条件下表现出不同的活性，但其具体功能仍需进一步研究。此外，我们还检测到了一些具有未知功能的蛋白质，这些蛋白质可能在木质纤维素降解中发挥重要作用。这些蛋白质的多样性表明，P. pulmonarius可能通过多种机制参与木质纤维素的降解过程，而不仅仅是依赖于已知的CAZymes。

在本研究中，我们还评估了P. pulmonarius分泌物对木质纤维素糖化的影响。通过将分泌物添加到预处理的木质纤维素底物中，我们发现玉米秸秆分泌物在糖化过程中表现出更高的效率。这可能与其诱导的多糖降解酶有关，这些酶在玉米秸秆的降解中起着关键作用。此外，我们还发现，抑制氧化还原酶可以显著提高糖化效率，这表明氧化还原酶可能在某些情况下抑制多糖降解酶的活性。这一发现对于设计高效的工业酶混合物具有重要意义，因为它揭示了氧化还原酶在木质纤维素降解中的潜在抑制作用。

通过将P. pulmonarius的分泌物补充到工业纤维素酶混合物中，我们进一步验证了其在生物质转化中的应用潜力。在玉米秸秆的预处理中，使用P. pulmonarius分泌物与Cellic?CTec2混合后，糖化效率显著提高。这种协同效应可能源于P. pulmonarius分泌物中富含的多糖降解酶，这些酶能够有效促进纤维素的分解。然而，需要注意的是，P. pulmonarius在糖化过程中的低纤维素酶活性可能与其在特定应用中的优势有关，例如在需要保持纤维素结构的纳米纤维素生产中。

综上所述，P. pulmonarius在不同木质纤维素底物上的分泌模式和酶活性表现出高度的灵活性和适应性。该菌株不仅能够分泌多种多糖降解酶，还能够适应不同的底物条件，表现出独特的生物催化特性。这些特性使其成为设计定制化酶混合物和推动生物精炼技术发展的有力工具。未来的研究需要进一步探索这些酶在工业环境中的应用潜力，以及它们在生物质转化中的具体作用机制。这将有助于开发更高效的生物基资源利用策略，推动可持续的生物燃料和生物材料生产。