在甲基诺霉素生物合成过程中发现对耐药革兰氏阳性细菌病原体具有活性的晚期中间体

《Journal of the American Chemical Society》：Discovery of Late Intermediates in Methylenomycin Biosynthesis Active against Drug-Resistant Gram-Positive Bacterial Pathogens

通过基因敲除和代谢分析，揭示了甲烯霉素生物合成中mmyD、mmyE、mmyO和mmyF的作用，发现中间产物premethylenomycin C lactone（5）和premethylenomycin C（6）具有显著抗菌活性，为开发新型抗生素提供依据。

　　甲烯霉素是一类高度功能化的环戊酮类抗生素，由链霉菌（*Streptomyces coelicolor*）A3(2)产生。这些化合物因其广泛的抗菌活性而备受关注，特别是对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，包括某些耐药菌株。尽管关于甲烯霉素生物合成途径的假设已有初步提出，但直到最近，仍缺乏直接实验数据来验证这些假设。本研究通过基因编辑技术，对四个可能参与甲烯霉素生物合成的基因（*mmyD*、*mmyE*、*mmyO* 和 *mmyF*）进行了研究，旨在明确这些基因编码的酶在甲烯霉素合成中的具体作用，并进一步探索其生物合成机制。

### 甲烯霉素的生物合成与基因簇

甲烯霉素的生物合成基因簇最初是在*Streptomyces coelicolor* A3(2)的巨型线性质粒SCP1中发现的。该基因簇包含13个基因，这些基因被认为与甲烯霉素的合成有关。通过对这些基因的序列分析，研究者提出了一个可能的生物合成途径，其中包括一系列酶促反应，如缩合、氧化还原、环化和环氧化等。例如，MmyD与AvrD具有47%的序列相似性，后者在植物内生菌的类黄酮合成中催化β-酮酰基硫酯与戊糖的缩合反应。因此，研究者推测MmyD可能在甲烯霉素的早期合成中起作用，负责将乙酰乙酰基MmyA（由MmyC和来自初级代谢的乙酰辅酶A乙酰转移酶生成）与戊糖缩合，形成一个丁烯内酯中间体，最终转化为甲烯霉素C（2），再通过MmyF和MmyO的催化作用形成甲烯霉素A（1）。

### 基因敲除实验与代谢物分析

为了验证这些基因在甲烯霉素合成中的功能，研究者对这些基因进行了“在框删除”实验。通过将这些基因替换为抗生素抗性基因（如apramycin抗性基因），并将其整合到*Streptomyces coelicolor* M145的基因组中，研究者构建了一系列突变株。随后，通过液相色谱-质谱（LC-MS）分析这些突变株的代谢产物，研究者发现，*mmyD*基因的缺失导致甲烯霉素A和C的完全缺失，这与MmyD在早期合成中的作用一致。而*mmmyF*和*mmyO*基因的缺失则导致甲烯霉素A的合成受阻，但甲烯霉素C仍可被检测到，这表明MmyF和MmyO可能负责将甲烯霉素C转化为甲烯霉素A的过程。

此外，研究者还发现，*mmyE*基因的缺失导致一种新的代谢物——前甲烯霉素C（6）的积累，而该代谢物能够通过环化形成前甲烯霉素C内酯（5）。这一发现表明，MmyE可能参与了前甲烯霉素C中外甲基烯基的引入过程。通过进一步的结构分析和核磁共振（NMR）技术，研究者确认了< b>5和< b>6的结构，并提出它们可能是甲烯霉素合成过程中的关键中间体。

### 甲烯霉素中间体的抗菌活性

在对这些中间体和产物的抗菌活性进行评估时，研究者发现，前甲烯霉素C内酯（5）和前甲烯霉素C（6）在对抗多种革兰氏阳性菌方面表现出显著的活性，尤其是对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）和多重耐药的粪肠球菌（Enterococcus faecium）等临床分离株。其最小抑菌浓度（MIC）值分别为1和2 μg/mL，远低于甲烯霉素A和C的MIC值（分别为256和512 μg/mL）。这一发现表明，前甲烯霉素C及其内酯形式可能具有更强的抗菌活性，可能成为开发新型抗生素的有力候选。

值得注意的是，尽管前甲烯霉素C内酯（5）缺乏甲烯霉素A和C中的外甲基烯基，但它仍表现出优异的抗菌活性。这提示我们，甲烯霉素的抗菌活性可能并非依赖于外甲基烯基，而是依赖于其γ-丁内酯结构。此外，研究者还发现，前甲烯霉素C（6）在酸性条件下更容易环化形成前甲烯霉素C内酯（5），这可能解释了< b>5在抗菌活性实验中表现出的较低但仍然显著的活性。

### MmyO和MmyF的催化机制

为了进一步验证MmyO和MmyF在甲烯霉素A合成中的作用，研究者设计了一个实验，将这两个基因与*mmr*基因（一种可能赋予甲烯霉素抗性的外排泵）一起在*Streptomyces coelicolor* M145中表达。结果表明，这种改造后的菌株能够将甲烯霉素C（2）转化为甲烯霉素A（1），从而确认了MmyO和MmyF的协同作用。此外，通过同位素标记实验，研究者发现甲烯霉素A中的氧原子主要来源于分子氧，这进一步支持了MmyO作为依赖分子氧的单加氧酶的假设。

然而，MmyO似乎对底物具有一定的选择性。当研究者将不同的底物（如前甲烯霉素C、前甲烯霉素C内酯、以及结构类似的化合物）引入到表达MmyO的菌株中时，只有前甲烯霉素C被有效环氧化，形成了一个不稳定的中间体，该中间体随后经历一系列重排反应，最终生成甲烯霉素A（10）。这一过程表明，MmyO可能只对特定的底物具有催化活性，其催化机制可能涉及一个E1cB机制，其中活性位点中的碱性残基生成烯醇中间体，而酸性残基则促进中间体的消除反应。

### 抗菌活性与耐药性研究

为了进一步探讨这些代谢物的抗菌机制，研究者对它们的抗菌活性进行了系统评估。结果显示，甲烯霉素A和C对革兰氏阴性菌几乎没有活性，这可能与其无法穿透外膜或被快速外排有关。相比之下，前甲烯霉素C及其内酯形式（5和< b>6）对革兰氏阳性菌表现出更强的活性。尤其是对MRSA和多重耐药的粪肠球菌，< b>5表现出极低的MIC值，这表明它可能成为对抗耐药菌的有效抗生素。

为了验证这些代谢物是否容易被耐药菌株发展出抗性，研究者对粪肠球菌64/3进行了长期的抗生素筛选实验。结果显示，粪肠球菌在28天的连续传代过程中，对甲烯霉素A的MIC值并未显著增加，而对甲烯霉素C的MIC值则有所上升。这一现象表明，< b>5可能比甲烯霉素A和C更难以被细菌发展出抗性，这使其成为开发新型抗生素的潜在目标。

### 甲烯霉素合成的其他酶与可能的进化路径

研究还发现，除了MmyD、MmyE、MmyO和MmyF之外，其他基因（如*mmyG*、*mmyK*、*mmyQ*、*mmyX*和*mmyY*）在甲烯霉素合成过程中也发挥重要作用。尽管目前尚无直接证据表明这些基因是否由相应的酶催化，但它们的缺失可能导致代谢物合成路径的变化，从而影响最终产物的形成。因此，未来的研究应重点关注这些基因在生物合成中的具体作用，以进一步完善甲烯霉素的合成机制。

此外，研究者推测，甲烯霉素的生物合成基因簇可能最初是为了产生一种更具抗菌活性的化合物——前甲烯霉素C内酯（5），而后续的基因获取（如*mmyT*、*mmyE*、*mmyO*和*mmyF*）可能将合成路径导向甲烯霉素C（2）和甲烯霉素A（1），后者可能具有不同的生物学功能。这一假设为未来探索其他具有弱抗菌活性或无抗菌活性的代谢物提供了新的思路，即通过研究这些中间体的结构和功能，可能发现更有效的抗生素。

### 结论与未来研究方向

综上所述，本研究通过基因敲除和代谢产物分析，明确了MmyD、MmyE、MmyO和MmyF在甲烯霉素合成中的具体作用。这些酶分别参与了早期的缩合反应、外甲基烯基的引入、以及最终的环氧化反应。此外，研究还发现，前甲烯霉素C及其内酯形式具有显著的抗菌活性，尤其是在对抗耐药菌株方面表现出色。这提示我们，这些中间体可能是开发新型抗生素的重要候选。

未来的研究可以进一步探索这些中间体的结构-活性关系，以及它们在抗菌机制中的具体作用。例如，通过合成不同的前甲烯霉素C衍生物，研究者可以评估其抗菌活性的变化，并揭示其关键结构特征。此外，由于前甲烯霉素C内酯（5）对耐药菌株表现出较强的活性，研究者认为它可能是开发新型抗生素的起点。目前，研究团队已与Lupton小组合作，开发了一种高效且通用的合成方法，以便制备多种前甲烯霉素C衍生物，从而进一步探索其抗菌机制和潜在应用。

本研究不仅为甲烯霉素的生物合成提供了更深入的理解，还为抗生素的开发提供了新的思路。通过揭示生物合成途径中的关键酶和中间体，研究者为未来探索其他具有抗菌活性的化合物奠定了基础。同时，这一发现也为对抗多重耐药细菌提供了新的策略，尤其是在当前抗生素耐药性日益严重的背景下，开发新型抗生素具有重要的现实意义。