综述：DNA编程的细胞组装：从细胞、组织到类器官

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：DNA-programmed cell assembly: from cells, tissues to organoids

本综述系统阐述了利用DNA（脱氧核糖核酸）作为可编程工具，通过DNA双链、DNA四面体、DNA折纸及DNA水凝胶等“工具箱”，实现细胞膜修饰及细胞间特异性识别与组装，进而构建从细胞簇、球体到分层组织乃至功能类器官的仿生架构。文章重点探讨了DNA编码技术在调控细胞间相互作用强度、特异性及动态逻辑门控方面的优势，并展望了其在再生医学、疾病建模及药物筛选中的应用潜力与当前挑战（如DNA稳定性、微环境控制及功能整合等）。

　　

DNA编程的细胞组装：从细胞、组织到类器官

在生物学和再生医学领域，如何将细胞精确地空间组织成功能性的组织是一个根本性挑战。传统的细胞组装方法往往缺乏特异性、可重复性以及动态控制能力，难以模拟天然组织的复杂结构。近年来，脱氧核糖核酸（DNA）作为一种可编程且生物相容性良好的分子工具，为工程化细胞-细胞相互作用和构建具有层次秩序的组织模型提供了新兴策略。DNA不仅承载遗传信息，其基于沃森-克里克碱基配对的可预测自组装特性，使其能够在纳米尺度进行精确的工程化设计，从而模拟天然的配体-受体识别机制，介导从纳米到毫米尺度的多种材料组装。DNA编程的细胞组装（DNA-programmed assembly of cells, DPAC）通过在细胞膜上功能化DNA纳米器件，使带有互补序列的细胞之间能够发生选择性识别，进而实现复杂组织仿生结构的可编程构建。

2 用于DNA编码细胞组装的策略

2.1 DNA工具箱

DNA自组装提供了一个从分子到介观尺度的多功能工具箱，主要包括DNA双链、DNA四面体、DNA折纸和DNA水凝胶，从而实现对细胞的多尺度和多功能控制。

DNA双链由两条通过特定碱基对间的氢键稳定的互补链组成，为可编程细胞组装提供了一个灵活且可控的平台。这种方法简单且适应性强，因为结合强度和特异性可以通过改变杂交长度和序列来调节。然而，DNA双链存在核酸酶降解导致的稳定性较差以及结合强度有限的问题。为提高耐久性，可采用化学骨架修饰和末端保护等策略。此外，开发能够结合多个互补序列的多价DNA分子，可以增加可组装的细胞数量，同时降低每个细胞所需的DNA密度。设计更刚性的二维和三维DNA框架结构可以减少核酸酶的可及性并增强结构协同性，从而提高稳定性。

DNA四面体是由DNA链自下而上组装而成的刚性三维纳米结构。与DNA双链相比，DNA四面体具有几何刚性，能够在纳米尺度上精确空间定位功能元件，从而实现对细胞间组装的精细控制。研究表明，带有三个疏水顶点的DNA四面体能够比单链DNA更稳定地锚定在细胞质膜上数小时，为细胞-界面工程提供了一个稳健的平台。例如，将DNA四面体锚定在抗原呈递细胞（Antigen-Presenting Cells, APCs）上，可以精确调节APCs与T细胞之间的膜间距，减小这一间距能显著增强T细胞受体（TCR）的触发和激活。利用DNA四面体的机械刚性和几何稳定性，还可以增强受体与癌细胞的结合亲和力，从而显著促进自然杀伤（NK）细胞与癌细胞的相互作用及其杀伤效率。

DNA折纸是通过将一条长的支架链与数百条短的订书钉链折叠而成，可产生具有纳米精度的二维和三维结构。相对于简单的双链介导的识别，DNA折纸将“点对点”的杂交升级为具有明确空间结构的“图案化”粘附，从而提高了细胞组装的精度和拓扑复杂性。例如，将膜锚定的DNA折纸用作分子尺度的膜结合试验板（Membrane-Bound Breadboard, MBB），可以编程同型或异型细胞-细胞结合，模拟生物膜上的受体-配体介导的识别和信号传导。通过控制适体（aptamer）在折纸上的特性、价态和空间排列，可以开发一系列可调节的多价适体DNA纳米结构，这些结构不仅能区分肿瘤类型、模拟多异源受体介导的识别，还能引导巨噬细胞与肿瘤细胞之间的特异性相互作用，从而实现有效的免疫清除，在个性化肿瘤治疗中展现出巨大潜力。

DNA水凝胶是通过DNA杂交形成的三维聚合物网络，结合了可编程性和生物相容性，可作为人工细胞外基质为细胞提供机械支撑。例如，设计的动态DNA交联基质能够通过修饰序列信息，计算预测并系统调节其粘弹性、热力学和动力学参数。这些基质支持多种细胞类型，并通过调节粘附配体和应力松弛来指导细胞极化和形态发生，为模拟组织力学和细胞-基质机械生物学提供了一个可编程平台。利用DNA水凝胶的可调力学和光响应特性，可以制造具有组织模拟、刚度可调的纳米工程DNA微球，这些微球能够在类器官内实现形态发生因子的时空控制释放，从而诱导产生具有体内类似细胞多样性的视网膜类器官，并重现形态发生梯度驱动的模式形成过程。

2.2 细胞表面DNA修饰

将DNA高效、精确且稳定地锚定到细胞表面是细胞表面工程和可编程组装的基础。直接化学缀合通过与膜蛋白上的赖氨酸或半胱氨酸残基形成共价键来实现，包括胺偶联、硫醇偶联和基于糖工程的偶联。这些方法稳定性好，应用广泛，但共价蛋白修饰可能影响修饰效率和可控性，且复杂操作可能影响细胞活力和天然功能。

疏水插入利用胆固醇、生育酚或长脂肪链等亲脂性基团嵌入脂质双分子层，从而将DNA暴露于细胞外环境。该策略简单、通用、对膜干扰小且可设计性强，但可能存在探针聚集以及DNA内化或脱落的问题。

抗体介导的靶向利用抗体-抗原识别将DNA定位到特定细胞上，具有高特异性和低脱靶效应，但受限于表面蛋白异质性、抗体成本、缀合复杂性和质量控制要求。

适体基靶向提供了在特定位点灵活、可定制的识别，与下游DNA反应兼容，非常适合在细胞组装过程中进行特异性识别和动态控制。

2.3 DNA编码的细胞组装

一旦单链DNA、DNA四面体或DNA折纸稳定地锚定在膜上，细胞就可以以可控的几何方式排列和组装。DNA水凝胶则提供了具有空间可编程性和光响应性的支架。在膜功能化的基础上，DNA的可编程反应性使得能够动态和智能地调节细胞间相互作用，为仿生通讯和程序化组装开辟了道路。

例如，设计的DNA三链体纳米开关（DNA Triplex Nanoswitches, DTNs）结合了Hoogsteen相互作用，允许在生理pH范围内进行构象转换，同时保持沃森-克里克稳定性。因此，微环境pH的波动会触发受控的识别和结合，实现pH依赖性组装，这对于肿瘤微环境等酸性生态位非常有用。

光响应DNA杂交技术通过光照射激活或失活DNA结合能力，提供了一种差异调控方法。研究表明，嵌入DNA链中的光可裂解保护基团可以在特定波长（425–450 nm）下被移除以恢复杂交，从而触发快速、时空分辨的细胞-细胞粘附。

此外，ATP响应性DNA自组装为动态多细胞调控提供了一条正交途径。利用拮抗的酶对（T4 DNA连接酶和BamHI限制性内切酶）来响应生理ATP浓度并维持DNA单体组装的动态稳态。以ATP作为化学燃料，该系统可逆地调节多细胞相互作用，为模拟免疫和组织再生中能量依赖的细胞行为提供了一种方法。

3 DNA编码在不同组织层次的细胞组装中的应用

3.1 细胞簇和球体

细胞簇和球体是探究结构稳定性、细胞间通讯和微环境自组织的基本单元。在DNA编程的细胞组装中，细胞间的粘附能取决于DNA链的杂交自由能（ΔG）及其膜锚定密度。研究发现，当改变碱基配对区域长度时，对应于12 bp和45 bp结合区域的分子粘附能分别为2.8 × 10⁶ kT和10.7 × 10⁶ kT。此外，锚定密度调节相邻细胞表面之间可以形成的键的数量。通过将DNA链浓度从150 μM降低到25 μM，可以实现高达20倍的组装速率变化。因此，通过DNA调节细胞间配对、耦合、微聚集体形成和球体组装，可以在早期建立细胞间接触的几何结构和粘附能景观，从而实现对细胞功能的精确控制。

DNA编码的单细胞配对利用上述工具箱创建高度选择性的异型耦合。例如，使用增强型DNA“魔术贴”技术，将单链DNA标记的细胞选择性地图案化在机械限定的光活性聚丙烯酰胺水凝胶上，实现了多种细胞类型的高精度空间排列和长期共培养，从而能够研究上皮-间质界面几何形状如何影响细胞骨架排列和细胞外信号调节激酶（ERK）信号传导，模拟组织边界处力学和生物化学的相互作用。利用DNA框架纳米结构扩展这些功能，可以实现可逆和可调的细胞组装及货物转移，凸显了DNA纳米结构在动态控制细胞-细胞相互作用方面的优势。使用掺入两亲性适体的DNA四面体选择性配对T细胞和单核细胞，利用单核细胞固有的肿瘤归巢能力增强肿瘤内T细胞浸润，为免疫工程和癌症治疗指明了新方向。

与通过天然粘附的随机聚类相比，DNA编码赋予拓扑结构、层比例和边界形状的高度可定制性。使用DNA编码的表面修饰来编程细胞间连接并控制3D组织自组装，构建了功能信号通路，揭示了Ras激活的细胞间变异性对乳腺上皮细胞形态发生的影响，突出了DNA编程在模拟组织微环境和信号转导方面的效用。通过改变序列互补性和结合强度可以动态调节此类过程。类似地，利用可编程碱基配对在多种微生物（包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和孢子）中设计模块化受体系统，实现了微生物簇的可控组装和动态响应，进一步扩展了DNA编程组装在合成生物学和微生物群落工程中的应用。

3.2 分层组织构建

多尺度组织表现出水平分层、嵌套结构、区域化和功能分区，这些决定了极性、屏障功能、质量传递和系统水平的力传导。DNA纳米技术能够以微米尺度的精度重新配置界面相互作用，以控制多层组装。

通过设计序列互补性和结合强度可以指导球体的组装，以控制方向和定位。在平面分层结构中，使用序列特异性链作为“魔术贴”在二维基底上以单细胞精度排列不同的细胞类型，实现了具有明确空间异质性的三维微组织的程序化构建。此外，开发了基于光刻DPAC（pDPAC）的“kinomorphs”，将成纤维细胞作为“折痕块”嵌入细胞外基质中以指导细胞-细胞连接性。由此产生的牵引力驱动形态发生转变，最终在预定位置实现细胞簇融合和管腔形成，展示了构建极化、功能性有管腔组织用于再生医学和疾病建模的强大潜力。

对于核壳结构，DNA纳米技术提供了可编程的空间组织，模拟了天然组织中细胞的区域化分布。用确定的DNA序列作为合成受体装饰细胞，能够基于互补性实现类型特异性识别和粘附，指导形成稳定的核壳单元。例如，引入干细胞与配对生态位共扩增（Expansion of Stem cells with Pairing Niches, ESPN）策略，将胆固醇修饰的单链DNA锚定在细胞膜上，实现乳腺干细胞与生态位细胞的配对，促进了干细胞增殖和维持。使用光刻结合DNA杂交，以微米级精度图案化多种细胞类型和配体，构建整合了恶性乳腺上皮细胞、非恶性乳腺上皮细胞和内皮细胞的多层结构，以模拟肿瘤微环境等复杂生理系统。这种方法具有高精度和灵活性，非常适合剖析细胞间信号传导、组织发育和疾病机制。

DNA纳米技术也已应用于构建动态核心-节点结构，适用于模拟发育或病理过程中发生的空间重组和信号转导。提出了一种“砖到墙”策略，利用DNA超分子水凝胶的自愈合和生物相容性，将不同细胞封装在离散模块中，这些模块融合成支持3D迁移和相互作用的多细胞核心-节点构建体。开发了基于DNAzyme的离子响应系统，使用Zn²⁺或Mg²⁺触发簇的受控解体和重组，甚至实现球体之间的可逆连接和定向迁移。此类方法支持逻辑操作，包括AND/OR门控，并为智能组织模型、动态药物筛选平台和可重构生物系统提供了分子水平的控制工具。

3.3 类器官构建

类器官通过精确控制细胞定位和相互作用来模拟器官结构和功能，为疾病建模、药物筛选和再生医学提供了可靠模型。DNA的序列特异性可编程性使得能够精确控制粘附、空间定位和细胞比例，解决了传统类器官培养在结构完整性、功能成熟度和批次间一致性方面的瓶颈。DNA纳米技术通过将分子识别与可编程组装相结合，提供了实现高度仿生和可控类器官的强大手段，从而减少变异性和结构或功能缺陷。通过调整细胞-细胞粘附、基质力学和多细胞组成，DNA引导的过程在空间和时间上引导类器官形成，以模拟器官发育和病理学。

利用膜锚定单链DNA的可逆粘附，创建了一种“化学微模塑”方法，用于快速、可控地3D聚集多种细胞类型。在基质胶支持下，该方法重现了乳腺等天然组织的空间形态，同时保留了自组织和微环境适应性。为减少与基质胶相关的变异性，应用pDPAC与DNA“魔术贴”在微孔阵列中精确控制肾单位祖细胞和输尿管芽细胞的比例，在97%的孔中实现了结构一致的肾脏类器官，并显著改善了近端小管结构的形态发生，优于传统方法。为增强均匀性和功能维持，证明了DNA折纸技术提供的卓越效率和可重复性。具体而言，所得球体表现出极低的尺寸变异性（<3.7%），并可在24小时内可靠生成，与悬滴法形成的粗糙且异质的结构形成对比。此外，该方法绕过了液体覆盖技术的细胞数量限制，可高效生产跨越广泛细胞数量范围（50–1,000,000个细胞）的球体。这种对组装过程的高度控制确保了结果的一致性，凸显了DNA编程组装增强的可重复性。这些代表性研究共同说明了DNA纳米技术在建高保真类器官方面的广度和控制力，为疾病建模、药理学和再生应用提供了精确可靠的平台。

4 挑战与展望

DNA编码的细胞组装为构建复杂组织和类器官提供了新的工程策略。其优势在于通过序列信息实现对细胞类型、数量、相对位置和功能的可编程控制。然而，该领域仍面临多重挑战。首先，DNA目前主要作为初始组装阶段的临时结构连接器。暴露的DNA会快速降解，后续细胞组装体的发育很大程度上依赖于自发的细胞相互作用。迫切需要开发新的材料策略，使DNA材料能够在组装体的整个生命周期中持续调控结构和功能。其次，现有的DNA编码组装技术对微环境的控制不足，难以重现体内复杂的生物化学和生物物理梯度，导致形态和功能成熟度存在差距。第三，高密度的DNA修饰可能会干扰细胞膜上天然信号受体或粘附分子的功能。通过优化DNA修饰密度、采用空间可控的DNA纳米材料进行靶向修饰以避免随机覆盖关键受体区域，以及开发刺激响应性DNA系统，可以在最大程度保留细胞天然生物学功能的同时实现精确的细胞编程。最后，当前方法大多实现了不同细胞类型的简单共组装，但缺乏精确的、更高层次的结构控制以及跨功能层次（如血管化、神经支配和免疫浸润）的耦合。

DNA编程细胞组装未来的进展可能源于与多学科技术的融合，桥接基础研究和临床转化。例如，与3D生物打印相结合，可将DNA编码的细胞模块作为“生物墨水”进行高精度空间堆叠，以快速构建宏观尺度、结构复杂的器官结构，同时在打印过程中协调分级力学和孔隙率以建立有序的生物力学微环境。整合患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）能够将DNA编码的细胞和类器官组装成具有指定组织功能的个性化、多层结构。结合机器学习和人工智能可以阐明和优化DNA序列-结构与构建体功能之间的映射关系，加速智能响应组织材料的开发。这种融合将推动DNA编程组装从静态构建走向动态调控和功能整合，实现按需制造具有生理功能的组织和器官。