中国广西北部罕见珠蛋白变异体的基因型和表型特征分析

《Frontiers in Immunology》：Genotypic and phenotypic characterization of rare globin variants in Northern Guangxi, China

广西北部地区罕见地中海贫血基因变体检测及表型关联研究，纳入3890名样本，常规检测发现44.27%携带常见突变，而罕见变体通过NGS/TGS等新技术检测到67例（1.72%），包括首次报道的4.3kb α-珠蛋白基因簇缺失（chr16:176935–181274DEL）及共存的-α4.3/-SEA杂合型与HbH病关联。研究揭示罕见基因型与血液学参数（MCV<82fL、HbA2<2.4%）及电泳特征（HbH/HbBart’s bands）存在显著相关性，为精准诊断和产前筛查提供依据。

　　本研究聚焦于广西北部地区人群中携带罕见地中海贫血基因变异的情况，旨在探讨其与血液学参数、血红蛋白电泳结果及表型特征之间的关系。地中海贫血是一种全球范围内最为常见且具有临床意义的单基因遗传病，主要由影响珠蛋白链合成的基因缺失或突变导致，从而破坏α-和β-珠蛋白的合成平衡，缩短红细胞的寿命，引发溶血性贫血。在中国，约有3000万人口携带地中海贫血相关基因变异，其中约有30万个体患有重型地中海贫血（TM）或中间型地中海贫血（TI），这些类型通常需要临床干预。尽管携带者一般不会表现出明显的健康问题，但两个携带者生育后代有25%的概率继承TM或TI。

目前，地中海贫血的管理主要依赖于长期输血和铁螯合治疗，这给患者及其家庭带来了显著的经济、时间和身体负担。尽管造血干细胞移植可能是一种根治手段，但其高昂的成本和有限的可及性限制了其应用。因此，预防措施在疾病控制中占据核心地位。自2010年起，广西地区政府启动了“广西地中海贫血预防与控制计划”，采用包括免费婚前筛查、孕前评估、产前筛查和产前诊断在内的综合策略。准确的地中海贫血基因分型是该计划的重要基础。

传统的地中海贫血基因检测方法，如反向点印迹杂交，已在临床实践中应用了二十多年。这些方法能够检测出三种常见的α-地中海贫血缺失、三种α-珠蛋白点突变和十八种β-珠蛋白点突变。然而，仍有部分病例无法通过这些标准方法确诊。目前，全球已鉴定出超过130种α-地中海贫血和超过300种β-地中海贫血的突变类型。例如，Tang等人通过结合下一代测序（NGS）、第三代测序（TGS）和染色体微阵列分析/拷贝数变异（CNV）测序，研究了72名疑似携带罕见地中海贫血变异的参与者，其中49例被发现携带不常见的α-或β-珠蛋白基因变异。

Yin等人在20例样本中报告了5例罕见地中海贫血病例，使用TGS技术进行分析。Zhuang等人对6174名参与者进行了遗传筛查，发现2390名携带α-或β-珠蛋白基因突变的个体，其中40人携带罕见或新型变异。Peng等人开发了一种基于TGS的“地中海贫血等位基因综合分析”方法，成功在100名出现异常血液学参数或血红蛋白电泳结果但常规基因检测为阴性的参与者中识别出10种临床相关变异，包括3种结构变异和7种单核苷酸变异。这些研究采用了GAP-PCR、NGS、TGS等分子技术以提高对罕见地中海贫血变异的检测能力。

广西北部地区，尤其是桂林，被认为是地中海贫血高发区域。桂林人民医院在过去六年中持续进行地中海贫血的遗传和产前诊断检测。研究结果揭示了该地区罕见地中海贫血变异的分布情况。

在本研究中，参与者的筛选和检测方法分为三个主要部分。第一组包括3890名参与者，他们于2019年3月至2025年3月期间在桂林人民医院产前诊断中心提供了外周血样本。参与者年龄范围从2至48岁，其中1826人为男性，2064人为女性。其中，834个样本来自接受联合筛查的夫妇。第二组包括13名参与者，他们因回顾性数据分析显示基因型与表型不一致而被纳入研究。这些参与者表现出地中海贫血的临床特征，但常规基因检测结果不一致。第三组包括834对夫妇，他们在同一中心进行了常规地中海贫血基因检测。对于被鉴定为携带者的一对夫妇，建议进行产前诊断。在这些情况下，会从孕妇中采集羊水样本进行胎儿地中海贫血基因分析。

本研究的纳入标准包括：(1) 常规基因检测结果为阴性但筛查结果为阳性的参与者，需满足以下六项中的一项：1) 平均红细胞体积（MCV）< 82 fL；2) 平均红细胞血红蛋白含量（MCH）< 27 pg；3) 血红蛋白（Hb）电泳显示HbA2 < 2.4%；4) HbA2 ≥ 3.5%；5) 胎儿血红蛋白（HbF）水平升高（通常≥2%）；或6) 异常血红蛋白谱。符合这些参数的参与者被归类为筛查阳性。此外，对于先前被诊断为TM或TI但仅表现出轻度贫血且常规基因检测结果为阴性的参与者，也进行了重新评估。继续检测为阴性的参与者随后被纳入对罕见地中海贫血基因变异的进一步分析。

排除标准包括涉及缺铁性贫血、免疫介导溶血或其他血液疾病的情况。所有参与者均需签署知情同意书，对于未成年人，由其法定监护人代为签署。研究方案已获得桂林人民医院伦理委员会的批准（批准号2022-072KY、2023-120KY）。

实验室方法主要包括外周血常规参数分析、血红蛋白电泳检测、血清铁蛋白检测以及地中海贫血基因检测。其中，常规基因检测包括GAP-PCR和RDB-PCR，用于检测四种α-地中海贫血缺失（αα/-α3.7、αα/-α4.2、αα/–SEA和αα/–Thai）和三种α-珠蛋白点突变（αα/ααCS、αα/ααWS和αα/ααQS）。此外，还分析了十八种β-地中海贫血突变，包括CD41–42、CD43、IVS-II-654、IVS-II-28、IVS-II-29、IVS-II-30、IVS-II-32、CD71–72、βE、CD17、CD31、CD37、CD14–15、CD27–28、IVS-I-1、IVS-I-5、CAP + 1和IntM。对于疑似携带罕见地中海贫血变异的样本，会转交给第三方实验室进一步分析，包括Yaneng生物科技有限公司、深圳易立方生物科技有限公司、北京华大基因和Berry基因科技有限公司。

在对罕见地中海贫血变异的检测中，采用了包括嵌套PCR、多重连接依赖探针扩增（MLPA）、桑格测序（第一代测序）、NGS、TGS以及基于新型CycloneSEQ纳米孔测序平台的长读长PCR。长读长测序使用CycloneSEQ WT-02单分子纳米孔测序仪，该协议经BGI Genomics机构审查委员会批准（IRB24094），能够全面检测HBA、HBB、HBD和HBG位点的遗传变异，包括单核苷酸变异（SNVs）、缺失和结构变异。

研究结果显示，3890名参与者中，常规地中海贫血基因检测共发现1081例α-地中海贫血、551例β-地中海贫血和90例同时存在α-和β-地中海贫血突变的病例，总体检测率为44.27%（1722/3890）。其余2168名参与者在常规检测中为阴性。在排除1375例与感染、缺铁性贫血等血液疾病相关的病例后，763例仍表现为筛查阳性，检测率为19.61%（763/3890）。对这763例参与者进行罕见地中海贫血基因检测，其中241人提供了知情同意。加上来自第二组的13例，共有254人接受了罕见变异检测，结果发现67例（见补充表1-7），其中罕见地中海贫血变异的检测率为1.72%（67/3890），而在常规检测为阴性的人群中，检测率上升至26.38%（67/254）。总共发现了42种罕见变异，包括25种α-地中海贫血、14种β-地中海贫血和3种δ-地中海贫血。

在α-珠蛋白基因簇中，发现了五种罕见的拷贝数变异（CNV），涉及八个病例（不包括泰国型缺失，因为这些缺失已被检测套件覆盖）。其中，α-珠蛋白基因簇包括α2.4缺失、4.3缺失（见图1A）、家族α90-93（-8bp）（AGCTTCGG）变异和家族HS-40缺失，以及一个重复事件。在β-珠蛋白基因簇中，发现了两种罕见CNV：一种为台湾型杂合子（见图1B）和一种为东南亚缺失与杂合子（见图1C）。

在α-珠蛋白基因簇中，发现了七种罕见的单核苷酸变异（SNV）。其中包括ααCD30（HBA2：c.91_93delGAG）的杂合子变异，该变异位于HBA2基因的外显子1中，影响蛋白质翻译。研究团队成员在广东省东南部、西南部和南部地区报道了该变异的临床表现，包括α+→α0，与多份文献报道一致。Lin等人在广东省韶关市报告了12例，表现出小细胞低色素性贫血和HbA2水平降低（见文献8）。在本研究中，一名成年男性表现出中度贫血、显著降低的HbA2和明显的HbH带，与Ren和Feng的研究结果一致，被归类为HbH病（见文献19和20）。

本研究还发现了一种相对罕见的HBA2：c.168dup变异，该变异在Hb电泳中表现为异常带。IVS-II-55（T > G）的杂合子变异在多个研究中被报道，通常在无贫血或小细胞低色素性贫血的情况下出现，且常伴随HbA2水平略有下降（见文献8和21）。在本研究中，该变异与CS点突变和δ-地中海贫血共存，其临床表现与文献中的报告相符（见文献23）。此外，还发现了一个涉及β-地中海贫血的PolyA（AATAAA > AATAAG）变异（HBA2：c.*94A > G），该变异影响β-珠蛋白链的合成平衡，导致HbA2水平下降。值得注意的是，该患者并未表现出贫血或小细胞低色素性贫血的临床特征，血红蛋白电泳数据未提供。

在β-珠蛋白基因簇中，发现了五种罕见的SNV。其中包括三种βN/βCD30（A > G）的杂合子变异（HBB：c.91A > G），一种βN/β-31（A > C）的变异（HBB：c.-81A > C），以及三种内含子变异：IVS-II-5（G > C）、IVS-II-81C和IVS-II-672（A > C）。研究发现，这些变异在常规检测为阴性但筛查为阳性的参与者中存在，但未表现出明显的贫血或小细胞低色素性贫血特征。文献中也有类似报告（见文献14和28）。

在涉及α-珠蛋白基因簇的复杂情况中，包括香港型、三联体、3.7 kb缺失和4.2 kb缺失，确认需要通过嵌套PCR结合MLPA或TGS进行。在本研究中，α-珠蛋白基因簇中携带香港型或三联体的个体的血液学参数通常在正常参考范围内，与Huang的报告一致。一名携带HKαα/ααCS的个体表现出轻微的MCH下降和正常的HbA2水平。Lin报告了两例，表现出轻微的MCH下降和HbA2水平低至1.5%（见文献11）。HKαα/??SEA的血液学特征与αα/??SEA携带者的相似，与Lin、Huang和Liang的报告一致。

本研究还发现了两种δ-地中海贫血变异，分别涉及HBD：c.31delG和HBD：c.31delG的复合突变。此外，还发现了一个携带ααCS/ααIVS-II-55基因型的α-地中海贫血变异，与δ-地中海贫血变异共存，表现出更低的HbA2水平，但未出现临床贫血。

在第二组中，回顾性分析临床记录发现13例基因型与表型不一致的病例。后续的罕见地中海贫血基因分析确认了其中9例的变异存在。

在讨论部分，研究团队进一步探讨了罕见变异与α-和β-珠蛋白基因簇中CNV的关系。在α-珠蛋白基因簇中，发现了五种罕见的CNV，包括α2.4缺失、4.3缺失、家族α90-93（-8bp）（AGCTTCGG）变异、家族HS-40缺失以及一个重复事件。其中，4.3缺失（chr16:176935–181274DEL）涉及α1基因和一个非功能的X–Y–Z段，这是首次在文献中报道。在本研究中，一名44岁男性最初被诊断为常规的αα/–SEA基因型，但通过长读长测序进一步分析，发现其基因型为?α4.3/??SEA，与HbH病相关。

在β-珠蛋白基因簇中，研究团队发现了五种罕见的SNV，包括βN/βCD30（A > G）、βN/β-31（A > C）以及三种内含子变异：IVS-II-5（G > C）、IVS-II-81C和IVS-II-672（A > C）。这些变异在常规检测为阴性但筛查为阳性的参与者中被发现，但并未表现出明显的贫血或小细胞低色素性贫血特征。文献中也有类似报告（见文献14和26）。

在涉及α-珠蛋白基因簇的复杂情况中，研究团队还发现了一种Hb Q-Thailand变异（HBA1：c.223G > C），该变异源于HBA1基因第74位密码子的GAC→CAC替换，导致α1-珠蛋白链N末端的天冬氨酸被组氨酸取代。该变异通常与?α4.2缺失型地中海贫血相关，临床表现通常为无症状，可能被误诊为简单的?α4.2缺失，增加漏诊风险。此前研究在广东韶关市发现Hb Q-Thailand是该地区最常见的血红蛋白变异之一（0.17%，17/10,285），尤其在梅州市的客家人中更为常见，同时也广泛分布于东南亚。

在本研究中，检测到两例?α4.2-Hb Q-Thailand/αα的病例，未表现出临床贫血、小细胞低色素性贫血或HbA2水平升高。在毛细管电泳中，异常血红蛋白带出现在F区，与之前的研究一致。然而，在与SEA缺失共存的复杂基因型中，可能导致HbH病的出现，若未适当调查，可能会导致漏诊。

Hb G-Honolulu（HBA2：c.91G > C）涉及α-珠蛋白链第31位的谷氨酰胺到谷氨酸替换，导致在特定阳离子交换高效液相色谱（HPLC）检测中，血紅蛋白亚成分的保留时间（RT）发生变化。此前研究指出，该变异可能干扰HbA1c测量，偶尔出现“E窗口”而非数值结果。在本研究中，异常血红蛋白带出现在D区，与Luo和Yang的研究结果相符（见文献11和27）。

Hb Hekinan（HBA1：c.84G > T）于1988年在日本首度描述，源于HBA1基因第27位的谷氨酸到天冬氨酸替换。由于没有净电荷变化，该变异可通过HPLC检测，但可能无法通过毛细管或醋酸纤维素电泳检测，增加漏诊风险。在本研究中，该变异通过TGS检测，且与γ-地中海贫血的Gγ-158C > T和Aγ-158C > T变异共存，导致HbF水平显著升高，尽管未出现临床贫血或小细胞低色素性贫血，但HbA2水平降低。这一特定复杂表现在文献中尚未见报道。

在β-珠蛋白基因簇中，Hb New York（HBB：c.341T > A）是一种血红蛋白变异，导致β-珠蛋白链第113位置的缬氨酸被谷氨酸取代。这种疏水残基与酸性残基的替换降低了β-链的整体疏水性，使血红蛋白分子结构稳定性降低，从而更容易被降解。尽管其相对常见，但通常不伴随明显的血液学异常或临床贫血。在毛细管电泳中，该变异表现为D区的异常带。在本研究中，异质性个体的异常血红蛋白平均浓度为43.05% ± 3.96%，与多项前期研究一致（见文献20、27、28、33、36）。

Hb J-Bangkok（HBB：c.170G > A）源于β-珠蛋白基因第56位的GGC→GAC替换，导致甘氨酸被天冬氨酸取代。这种氨基酸替换引起β-珠蛋白链的构象变化。Hb J-Bangkok是仅次于HbE和Hb New York的常见血红蛋白变异。其临床表现与Hb New York相似。在毛细管电泳中，Hb J-Bangkok表现为异常血红蛋白带与HbA2带在Z12区重叠。在本研究中，检测到四例Hb J-Bangkok异质性病例，异常血红蛋白浓度为43.05% ± 3.96%，与文献中的报告一致（见文献5、11、20、27、33）。

Hb G-Taipei（HBB：c.68A > G）是β-珠蛋白基因第22位的谷氨酸到甘氨酸替换，导致HbA1c的保留时间比HbA0更长，这是由于突变引入的正电荷增加所致，从而表现出HbA1c含量的升高。在本研究中，Hb G-Taipei异质性个体的毛细管检测显示异常血红蛋白带占42.7%，与文献中的报告相符（见文献27和33）。

HbO-Arab（HBB：c.364G > A）是一种罕见的β-珠蛋白变异，源于β-珠蛋白链第121位的谷氨酸到赖氨酸替换，有效取代正常HbA。HbO-Arab异质性的个体通常表现出正常的血红蛋白水平。在本研究中的一个案例中，异常血红蛋白带与HbA2和HbF区域重叠。Minjar Kalai等人报告称，HbO-Arab纯合子个体表现出轻度至中度贫血（见文献38）。Van Gammeren等人描述了一名携带HbO-Arab（HBB：c.364G > A）和Hb D-Los Angeles（HBB：c.664G > C）的新生儿，在一年内出现轻度的小细胞贫血（见文献39）。Elbashir等人报告了13名2.7至62.5岁的Hb S/O个体，均表现出溶血性贫血（见文献40）。这些发现表明，HbO-Arab的临床表型具有高度变异性，若与其它血红蛋白变异或β-地中海贫血共存，可能会比三种更常见的Hb变异更具临床影响。

Hb Barcelona（HBB：c.283G > C）是一种罕见的血红蛋白变异，源于β-珠蛋白链第94位的天冬氨酸到组氨酸替换。该突变首先由Aguilar等人在西班牙家族中描述，表现为轻度红细胞增多（见文献41）。Phillips等人功能研究显示，Hb Barcelona的氧亲和力比正常HbA高出约两倍，这可能是携带者中出现红细胞增多但无贫血的原因（见文献42）。在本研究中，Hb Barcelona的异常血红蛋白占34.8%，与Phillips等人报告的37%相符（见文献42）。

研究还发现，涉及α-或β-珠蛋白链的异常血红蛋白变异通常在血红蛋白电泳中表现为异常带。这些带的检测性可能有所不同，一些较为明显，而另一些则较为隐晦，需要通过NGS或TGS进一步确认。与典型的地中海贫血综合征不同，异常血红蛋白病通常不伴随小细胞低色素性贫血特征，这有助于其鉴别诊断。此外，Hb Q-Thain是与?α4.2缺失相关的一种常见变异，当与4.2缺失相互作用时，可能导致HbH病的表型，若未适当调查，可能增加漏诊风险。

在δ-地中海贫血方面，研究发现该病主要由点突变引起。无论是δ0-还是δ+-地中海贫血，若为纯合子或杂合子，通常不会产生临床症状。主要的血液学特征是HbA2水平的降低。到目前为止，已报道了19种不同的突变类型，包括?77 T > C、?65 A > C和CD30 G > C（见文献43）。Zhang等人报告称，在云南人群中，δ-地中海贫血的患病率为0.49%，这比其他中国南方人群中的0.4%略高（见文献44）。

在本研究中，检测到87/195样本中存在δ-珠蛋白基因突变，其中最常见的突变是?77 T > C，占88.51%（77/87），其次是 ?30 T > C（3.45%，3/87）和起始密码子突变（ Met > Ile）（2.30%，2/87）。检测到两例HBD：c.31delG的杂合子病例，均表现出HbA2水平为1.4%。此外，还发现了一例携带ααCS/ααIVS-II-55基因型的α-地中海贫血，与δ-地中海贫血突变（CD65 A > T和CD115 C > T）共存，表现出更低的HbA2水平（0.7%）且无临床贫血表现。

研究还指出，罕见的基因型与不同的血液学特征和血红蛋白电泳图谱相关。临床中，罕见基因型可以通过整合表型特征和相应的血液学参数模式进行初步推断。选择适当的诊断方法或多种方法的组合，有助于提高诊断准确性，减少漏诊或误诊的可能性，并支持有效的产前和产后管理策略。此外，这些罕见基因型的存在也丰富了该地区的地中海贫血突变谱，为疾病的区域流行病学研究提供了重要数据。