HTGTS-TCR-Seq用于分析小鼠和人类T细胞受体α和β基因的重排及多样性

《Advanced Science》：HTGTS-TCR-Seq for Profiling of Mouse and Human T-Cell Receptor α and β Gene Rearrangements and Diversity

αβ T淋巴细胞通过V(D)J重排生成TCR多样性，该过程将胚系V、D、J基因片段组装为Tcra和Tcrb基因。现有方法如多重PCR和5'RACE存在固有局限性。本研究提出HTGTS-TCR-seq方法，通过3-5个J或V区域引物富集重排产物，同时检测有功能和无功能重排。该技术应用于不同发育阶段的小鼠胸腺细胞及衰老T细胞，揭示了阶段特异性V/J基因使用和年龄相关谱系改变。Wapl基因敲除的胸腺前体双阳性细胞分析显示WAPL在无细胞分裂依赖的Tcra重排中起关键作用。进一步分析人类外周T细胞，发现CDR3保守特征及亚群特异性Vβ使用。综上，HTGTS-TCR-seq为跨发育、衰老及免疫相关条件下的TCR重排和多样性定量分析提供高效便捷的策略。

　　T细胞受体（TCR）是适应性免疫系统中至关重要的组成部分，它使T细胞能够识别广泛存在的抗原。TCR的多样性是通过V(D)J重组过程产生的，该过程将基因片段组合成功能性TCR α链和β链。这种重组机制不仅确保了T细胞对不同抗原的识别能力，还为免疫系统提供了高度的适应性。然而，分析TCR重组和多样性仍然面临挑战，因为传统的技术方法存在技术局限性。例如，多重PCR方法虽然在DNA和mRNA水平上被广泛应用，但其需要大量的引物，并且容易受到引物偏好性偏差的影响。而5′RACE方法虽然避免了引物偏好性，但在获取和保存mRNA样本方面较为困难，同时无法全面检测涉及等位排斥的双等位重组事件。

为了克服这些局限性，研究者开发了一种新的高通量方法——高通量基因组转位测序（HTGTS）为基础的TCR测序（HTGTS-TCR-seq）。这种方法利用有限数量的J或V区域引物，对TCR α和β基因的重组事件进行无偏见的捕获，从而实现对重组片段的定量分析。HTGTS-TCR-seq不仅能够检测到功能性重组，还能够捕捉到非功能性重组事件，为研究T细胞发育和免疫功能提供了新的视角。通过应用该方法，研究人员对小鼠T细胞群体进行了分析，包括发育阶段的DN3和预选DP细胞，以及外周CD4?和CD8?T细胞。此外，该方法还扩展到了人类外周血单个核细胞（PBMCs）中，成功地分析了人类CD4?和CD8?T细胞的TCR多样性。

在小鼠研究中，HTGTS-TCR-seq揭示了TCRβ基因在DN3和预选DP细胞中的重组特征。DN3细胞在发育过程中优先使用特定的Vβ片段，而预选DP细胞则表现出更广泛的Vβ片段使用，但其中一些片段如Trbv30的使用频率显著降低。这一结果表明，TCRβ的重组模式随着发育阶段的不同而发生变化，且与β选择的进程密切相关。此外，该方法还检测到了不同Dβ片段的使用频率，显示了在不同发育阶段中DβJβ重组的动态变化。通过对比不同Jβ引物的使用，研究人员发现DN3细胞中DβJβ重组的比例显著高于预选DP细胞，这与Dβ到Jβ的重组在DN3阶段优先发生有关。

在分析TCRα基因重组时，HTGTS-TCR-seq显示了小鼠预选DP细胞中Vα和Jα片段的使用模式。与TCRβ不同，TCRα的重组并不受等位排斥的限制，通常在两个等位上发生。研究人员使用了五种不同的Jα引物和四种Vα引物，以捕捉TCRα重组的广泛多样性。结果表明，随着Jα引物位置从近端向远端变化，Vα片段的使用也相应地向更远端的Vα区域转移。此外，某些Vα片段在不同引物条件下表现出特定的偏好性，这可能与基因片段的空间排列和染色质可及性有关。

通过比较HTGTS-TCR-seq与传统方法如5′RACE和多重PCR的结果，研究人员验证了该方法的有效性和可靠性。HTGTS-TCR-seq能够检测到5′RACE难以识别的伪基因片段，如Jα61，并且其结果与DNA水平的重组事件更加一致。相比之下，传统方法可能因引物偏好性而遗漏部分重组事件，或者在分析非功能性重组时存在偏差。这些发现表明，HTGTS-TCR-seq在捕捉TCRα和β的重组事件方面具有更高的准确性和更广泛的适用性。

在年龄相关的研究中，HTGTS-TCR-seq被用于分析年轻和年老小鼠的胸腺细胞以及外周T细胞的TCR多样性。结果表明，随着年龄的增长，胸腺细胞的TCRβ重组模式保持相对稳定，但非功能性重组的比例有所上升。相比之下，TCRα的多样性在年老个体中显著下降，这可能与胸腺功能的衰退有关。此外，年老外周T细胞中Vα片段的使用模式与胸腺细胞相似，进一步支持了胸腺功能对T细胞受体多样性的关键作用。

在人类外周T细胞的研究中，HTGTS-TCR-seq同样展示了其有效性。研究人员分析了CD4?和CD8?T细胞的TCRβ和TCRα多样性，发现两者在Vβ和Vα片段的使用上存在明显的差异。例如，某些Vβ片段在CD4?T细胞中更常见，而另一些则在CD8?T细胞中表现出偏好性。这些结果表明，TCRβ的组成可能在很大程度上决定了T细胞亚群的身份。同时，CDR3序列的长度和结构特征在人类和小鼠中表现出高度的保守性，进一步强调了TCRβ在免疫识别中的核心作用。

此外，HTGTS-TCR-seq还揭示了WAPL在TCRα重组中的作用。WAPL是一种与染色体结构相关的因子，其在胸腺细胞中的表达模式提示其可能在T细胞发育过程中发挥重要作用。通过条件性敲除WAPL，研究人员发现其缺失导致了TCRα重组模式的改变，特别是Jα片段的使用偏好性发生转移。这些发现不仅加深了对TCR重组机制的理解，也为进一步研究染色体动态变化对免疫系统的影响提供了新的方向。

尽管HTGTS-TCR-seq在多个方面表现出色，但该方法仍然存在一些局限性。例如，基因组DNA的碎片化过程可能影响目标序列的完整性，而低输入DNA量可能导致检测灵敏度下降。此外，由于TCRα和β基因座的高度重复性，设计特异性引物存在一定的挑战，这限制了该方法对所有可能重组事件的全面覆盖。为了克服这些局限，研究人员建议进一步优化引物设计，扩大引物池的规模，并结合其他技术手段以提高方法的适用性。

总体而言，HTGTS-TCR-seq为研究TCR的多样性提供了新的工具。它不仅能够有效捕捉TCRα和β的重组事件，还能在不同发育阶段、年龄和免疫相关条件下进行定量分析。这一方法在小鼠和人类中均表现出良好的适用性，为理解T细胞发育和免疫功能提供了新的视角。未来，随着技术的进一步优化和应用的拓展，HTGTS-TCR-seq有望成为研究T细胞受体多样性的重要手段，推动免疫学领域的深入发展。