基于短肽的超分子纳米复合水凝胶：用于破坏多重微生物生物膜并加速感染伤口愈合

《Biomaterials Science》：Short-peptide based supramolecular nanocomposite hydrogels for the disruption of polymicrobial biofilms and accelerated infected wound healing

纳米银/金颗粒协同短肽水凝胶通过光催化合成实现高效广谱抗菌，可破坏MRSA与念珠菌的生物膜，减少炎症反应并促进伤口愈合。

　　近年来，耐药微生物的快速传播以及其在单菌种或混合菌种生物膜中的持续存在，成为全球医疗领域面临的重要挑战。金属纳米颗粒，尤其是银纳米颗粒（AgNPs）和金纳米颗粒（AuNPs），因其强大的抗菌活性而备受关注，但其合成过程复杂、依赖外部还原剂和表面活性剂，导致生物相容性受限以及在体内的应用效果不佳。为了解决这些问题，本研究提出了一种简便、生物相容性良好的方法，通过一种一步法水相合成过程，使AgNPs和AuNPs能够在短肽的超分子相互作用下实现原位生长。利用阳光照射，这些水凝胶能够在不依赖外部还原剂的情况下形成纳米颗粒并作为其稳定剂。金属水凝胶展现出快速且广谱的抗菌活性，能够有效对抗多重耐药细菌和真菌。此外，这些水凝胶不仅能够破坏单一菌种生物膜，还能显著消除由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和白色念珠菌（C. albicans）形成的混合生物膜。水凝胶能够实现微生物存活率≥1.5个对数的减少，其效果优于最后手段抗生素和市售银基软膏。体内研究表明，这些水凝胶能够加速伤口愈合，通过减少细菌负担和减轻炎症反应，同时促进新生血管生成、肉芽组织形成、成纤维细胞增殖、胶原沉积和上皮化。这些基于肽的金属水凝胶的温和、经济的合成方式和强大的抗菌效果，凸显了其在治疗混合生物膜相关感染中的临床潜力。

在引入部分中，耐药细菌和真菌感染的增加使得传统的治疗方法难以应对。生物膜的形成在几乎所有生物和非生物表面都很常见，这使得微生物更容易形成多菌种（细菌和真菌）或多种细菌（革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌）的生物膜。真菌和细菌之间的跨域相互作用在改变定植、毒力以及对宿主免疫反应和现有抗菌药物的敏感性方面起着关键作用，导致传统疗法效果不佳。因此，迫切需要开发新型广谱抗菌药物和生物材料，能够有效对抗细菌、真菌和混合感染，同时具有良好的生物相容性。

金属纳米颗粒，尤其是AgNPs，在对抗多种细菌、真菌和病毒方面展现出强大的杀菌活性，不易产生耐药性。银能够增加微生物细胞的通透性，并通过与电子丰富的基团结合，破坏酶和DNA。银基制剂以多种形式存在，如可溶性盐、纳米颗粒以及与不同载体（如聚合物）结合的制剂。然而，AgNPs在高剂量或长时间使用时会表现出细胞毒性。因此，开发更生物相容的广谱杀菌剂，通过更简单、成本更低的方法，是当前的研究方向。在这种背景下，使用含有抗菌剂的水凝胶或具有内在抗菌活性的水凝胶，可以成为一种有效策略，因为水凝胶通常具有良好的生物相容性和可降解性。特别是基于芳香肽的短肽超分子水凝胶，在该领域显示出广阔的应用前景，因为某些肽具有内在抗菌活性，而其他肽可以用于通过温和的方法获得AgNPs，并表现出优秀的抗菌性能。这些肽可以在非常温和的条件下形成水凝胶，通过金属盐的加入、pH值或溶剂的变化，或通过酶的催化作用，促进肽的自组装和超分子水凝胶的形成。将水凝胶与天然聚合物（如胶原蛋白、透明质酸、纤维蛋白等）结合，可以进一步提高其生物相容性。此外，水凝胶还可以与具有生物活性的肽片段结合，如RGD（精氨酸–甘氨酸–天冬氨酸），它能够促进细胞附着。

基于上述假设，我们制备了含有不同短肽和金属纳米颗粒复合物的抗菌超分子纳米复合水凝胶（ASNH），目标是获得具有强大抗菌活性的生物相容性材料。为此，我们结合了Fmoc-FF（Fmoc-二苯基丙氨酸）/Fmoc-RGD（Fmoc-精氨酸–甘氨酸–天冬氨酸）/胶原蛋白与AgNPs和AuNPs。值得注意的是，AuNPs的抗菌性能相比AgNPs研究较少，同时用于其合成的温和方法也较少。在本研究中，这些水凝胶能够通过简单的阳光照射方法产生两种类型的金属纳米颗粒，避免使用可能影响系统生物相容性的外部还原剂。复合水凝胶起到了包裹和稳定纳米颗粒的作用。Fmoc-RGD和胶原蛋白的加入使得水凝胶更加生物相容，并控制了颗粒的尺寸和形态。在肽纤维中形成金属纳米颗粒不会影响复合金属水凝胶的机械性能。经过优化，具有快速抗菌活性和低溶血活性的水凝胶被筛选出来。对这些水凝胶的快速和广谱抗菌活性进行了研究，并详细阐述了其杀菌机制。此外，还评估了这些水凝胶对细菌和真菌生物膜以及其共存的混合生物膜的破坏效果。最后，在小鼠模型中对水凝胶的体内伤口愈合能力和抗菌性能进行了研究。

在结果与讨论部分，首先测试了Fmoc-FF在简单添加银盐（AgNO3, 100 mM）和金盐（HAuCl4, 100 mM）后的凝胶形成能力。为此，制备了Fmoc-FF（10 mM）的水溶液，并添加不同浓度的AgNO3或HAuCl4（0.1–7 mM）。较低浓度的AgNO3或HAuCl4未能导致水凝胶形成。3 mM AgNO3或HAuCl4是触发水凝胶形成的最低浓度。然后将样品暴露在阳光下，按照已描述的协议诱导金属纳米颗粒的形成。结果显示，ASNH-1、ASNH-2和ASNH-3含有AgNPs，ASNH-7、ASNH-8和ASNH-9含有AuNPs未能形成水凝胶，而ASNH-4、ASNH-5和ASNH-6含有AgNPs以及ASNH-10、ASNH-11和ASNH-12含有AuNPs形成了水凝胶。经过24小时后，水凝胶的颜色从透明变为深棕色（AgNPs）或黑色（AuNPs），表明金属纳米颗粒的形成。透射电子显微镜（TEM）图像确认了AgNPs和AuNPs的形成，其中AgNPs的尺寸约为3.9 ± 0.7 nm，AuNPs的尺寸约为19 ± 4 nm。在AuNPs的情况下，除了球形颗粒外，还观察到三角形颗粒。AgNPs与肽纤维高度结合，表明Fmoc-FF作为还原剂和稳定剂的作用。在制备了ASNH-AgNP和ASNH-AuNP水凝胶后，初步筛查了它们对革兰氏阳性菌MRSA ATCC 33591和革兰氏阴性菌大肠杆菌（E. coli MTCC 443）的抗菌活性。所有水凝胶在12小时的培养后都显示出对两种细菌的强效作用，将细菌负担减少至每毫升约50个CFU（<50 cfu ml?1）。

为了进一步提高水凝胶的生物相容性，考虑了AgNPs的潜在毒性，决定通过引入Fmoc-RGD和胶原蛋白来制备更生物相容的水凝胶。Fmoc-RGD和胶原蛋白都是已知的具有体内生物相容性和促进细胞附着和生长的成分。此外，Fmoc-RGD作为一种酸性肽，有助于凝胶形成，从而降低金属盐的浓度。根据我们之前的实验经验，制备了一种由Fmoc-FF（20 mM）、Fmoc-RGD（20 mM）和胶原蛋白（3 mg mL?1）按3.5:1.5:5比例组成的复合水凝胶（Antimicrobial Supramolecular Hydrogel, ASH）。有趣的是，ASNH中氨基酸残基的极性基团可以作为Ag和AuNPs的相互作用点，使其成为稳定纳米颗粒的候选材料。通过不同的电子显微镜技术对水凝胶进行了表征。TEM图像显示复合水凝胶具有特征性的Fmoc-肽纤维，表明胶原蛋白的加入并未显著改变肽的自组装或超分子水凝胶的形成。ESEM图像显示了一些分布在片状结构中的球形聚集体。这些聚集体未在Fmoc-肽凝胶中观察到，可能是由于胶原蛋白的加入。FT-IR光谱显示了Fmoc-二肽的特征峰，如酰胺I峰在1692 cm?1（被认为是碳酸酯基团的堆积）和1652 cm?1，以及酰胺II峰在1534 cm?1，这些信号表明β-折叠结构的形成。胶原蛋白的加入不仅在Fmoc-二肽的酰胺I和II峰上重叠，还提供了与胶原蛋白三螺旋的二级结构相关的信号，如1445 cm?1和酰胺III峰在1256 cm?1，后者相对于1240 cm?1有所蓝移。这种酰胺III峰被归因于三螺旋中丝之间的氢键，其在复合材料中的位移可能是由于Fmoc-肽的加入改变了氢键模式。其他酰胺III峰在1287 cm?1和1201 cm?1也属于胶原蛋白三螺旋。

随后，评估了水凝胶的水吸收和保持能力。在伤口愈合应用中，保持湿润环境和确保高氧渗透性是两个关键要求。ASNH-13和ASNH-19的平衡水含量（EWC）首先被测量，两种水凝胶均表现出异常高的水含量，达到96–97%。这证实了它们维持伤口湿润和促进氧气运输的潜力。然后评估了水凝胶的水保持能力。由于水保持与水凝胶的弹性密切相关，较高的水含量通常对应于更柔软、更灵活的凝胶，因此这一性质特别重要。ASNH-13和ASNH-19在6小时和4小时后仍能保持约50%的水，表明ASNH-13比ASNH-19保持水分时间更长。ASNH-13的优越保持能力可能与其较小的孔径有关，这有助于减少水分流失。水凝胶的膨胀行为也被分析。ASNH-13表现出超过5倍的膨胀率，而ASNH-19的膨胀率超过13倍，验证了它们能够吸收大量伤口液体的能力。然而，随着时间的推移，膨胀率下降，表明在延长的PBS溶液中培养时，水凝胶会逐渐分解。这种分解可能与水凝胶的超分子特性有关。在没有化学交联剂的情况下，干燥过程可能导致聚合网络坍塌，使水凝胶变得多孔、脆弱并机械性能下降。与较高的孔隙率相比，ASNH-19在初始膨胀后会发生分解。

在机械性能测试中，复合水凝胶（ASNH-13和ASNH-19）表现出与不含金属纳米颗粒的对照水凝胶（ASH）相似的趋势，无论是频率扫描还是振幅扫描。因此，可以得出结论，这些水凝胶表现出典型的弱凝胶特性。唯一显著的不同在于ASNH-13和ASNH-19的存储模量（G′）和损耗模量（G′′）的数值与不含AuNPs或AgNPs的样品相比。在这一点上，AgNPs的加入显著增强了ASNH-13水凝胶的强度，如G′和G′′的数值增加。相比之下，AuNPs的加入略微削弱了ASNH-19水凝胶的强度，尽管这种影响在标准差范围内。这种差异可能与AuNPs的浓度较高有关，约为AgNPs的十倍。已有研究一致报告称，纳米颗粒的加入可以增强水凝胶的机械强度，通过作为交联点或结构支撑。然而，一些报告也指出，当纳米颗粒浓度超过临界值时，机械增强效果会减弱甚至逆转，导致强度下降。这一现象在聚合物和肽基水凝胶中均有观察。其潜在机制可能与高浓度纳米颗粒对聚合物或肽网络的过度破坏有关，这会损害水凝胶的结构完整性，最终降低其机械强度。

在结果与讨论的另一部分，研究了基于超分子纳米复合水凝胶的快速、剂量依赖的抗菌活性及其最小的溶血作用。制备的水凝胶对MRSA和E. coli的抗菌活性被测试，结果表明，不含金属纳米颗粒的对照水凝胶（ASH）对细菌数量的减少完全无效。含有AgNPs的水凝胶（ASNH-13、ASNH-14、ASNH-15和ASNH-16）表现出快速的杀菌动力学，能够在6小时内消除所有病原体。杀菌动力学被观察到是剂量依赖的。含有相对较高AgNP含量的水凝胶（ASNH-14和ASNH-15，分别由0.5 mM和1 mM Ag盐制成）在3小时内对两种细菌均实现了约6个对数的减少。另一方面，含有AuNPs的水凝胶（ASNH-17、ASNH-18、ASNH-19和ASNH-20）显示出相对较慢的杀菌动力学。ASNH-19水凝胶（由1 mM Au盐制成）在6小时内才能消除所有细菌细胞。然而，对E. coli，它能够在3小时内完全消除细菌细胞。金属纳米颗粒对革兰氏阴性菌的杀菌动力学相对较快，这一点在文献中有广泛报道。ASNH-17水凝胶（由0.1 mM Au盐制成）的抗菌活性低于其AgNP对照物，证明了AgNPs的优越抗菌活性。

在结果与讨论的另一部分，研究了水凝胶的多方面杀菌机制，包括活性氧（ROS）生成、膜去极化和膜通透化。为了深入了解水凝胶的杀菌机制，进行了一系列显微镜和光谱实验。金属纳米颗粒如AgNPs和AuNPs通过与蛋白质的硫醇和氨基基团、核酸以及细胞膜相互作用，产生ROS。ROS的过度生成，包括超氧和羟基自由基，是细菌细胞死亡的关键原因，因为它会导致细胞内广泛损伤。羟基自由基可以引起DNA断裂、脂质过氧化和蛋白质羰基化，破坏细胞完整性。为了评估水凝胶对MRSA细胞的ROS生成，使用了ROS敏感的荧光探针2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）。这种非荧光、细胞穿透性分子在细胞内被水解，并与ROS反应形成DCF，一种荧光化合物。与未处理对照组相比，处理后的细胞荧光强度显著增加，证实了细胞内ROS的生成。ASNH-13水凝胶由较低Ag盐浓度（0.1 mM）制备，诱导的ROS水平高于由较高Au盐浓度（1 mM）制备的ASNH-19水凝胶。这种增加的ROS生成归因于AgNPs的更高反应性，有助于与细菌细胞成分的更大相互作用。这些发现共同表明，水凝胶能够诱导细胞内ROS生成，这是细菌细胞死亡的关键机制。

为了进一步证明水凝胶的膜去极化能力，进行了膜去极化实验。ROS的生成可以直接导致细菌细胞膜脂质过氧化，破坏膜的结构和功能，由于自由基链反应。受损的脂质可以改变细胞膜的流动性和完整性，影响运输过程，并可能导致细胞泄漏。这种对离子稳态的改变会引发膜电位的改变，这通过膜电位敏感的染料3,3′-二丙基硫代二羰氰染料碘化物[DiSC3（5）]进行了研究。染料在正常膜电位条件下分布在微生物细胞内外。结果，荧光强度由于自猝灭而在微生物细胞内降低。当膜活性剂破坏膜电位时，它们会促进染料从细胞内释放到细胞外，导致荧光强度随时间逐渐增加。在本研究中，水凝胶的处理导致了显著且时间依赖的荧光强度增加，表明细菌跨膜电位的显著去极化。值得注意的是，含有AgNPs的复合水凝胶表现出更强的效果，归因于其优越的抗菌活性。这些发现表明，水凝胶能够有效去极化膜电位，从而杀死微生物。

为了进一步证明水凝胶的膜通透化能力，使用了活/死实验，通过Syto-9和PI（碘化丙啶）进行。MRSA细胞在与水凝胶共培养4小时后，同时用Syto-9（绿色发射）和PI（红色发射）染色。Syto-9是一种膜穿透性染料，可染色活细胞和受损细胞，而PI是细胞不穿透性染料，仅选择性染色死细胞或膜受损细胞。在未处理对照组中，未观察到红色细胞，表明存在膜完整性良好的活细胞。然而，水凝胶处理后，MRSA细胞被Syto-9和PI同时染色，表明存在膜完整性受损的死细胞。这些结果进一步证明了水凝胶的膜破坏活性，导致细菌细胞死亡。这一发现进一步确认了水凝胶作为与细菌膜相互作用并破坏其的机制。活/死染色结果与之前的发现相结合，支持了水凝胶通过作用于细菌膜来发挥抗菌活性的观点。

在结果与讨论的另一部分，研究了水凝胶对已建立生物膜的破坏能力，其效果与最后手段抗生素相当。微生物生物膜是多细胞结构，由自产的细胞外基质组成，起到抗菌剂的扩散屏障作用，并主要包含处于休眠或代谢不活跃状态的细菌细胞。因此，与游离细菌相比，生物膜相关的微生物表现出显著更高的抗菌剂抗性。因此，我们评估了优化后的水凝胶对MRSA和P. aeruginosa成熟生物膜的抗生物膜特性。水凝胶表现出显著的细菌负担减少。对于MRSA生物膜，它们显示出约2个对数（约99%）的细菌细胞活力减少。另一方面，对于P. aeruginosa生物膜，它们表现出更高的活性，将细菌负担减少了>2.5个对数（>99%）。最后手段抗生素万古霉素（用于革兰氏阳性菌）和多粘菌素（用于革兰氏阴性菌）显示出相似的抗生物膜活性，并将生物膜细菌数量减少了约1.5–2个对数。相比之下，市售的银基软膏Silverex?（含有银硝酸盐，0.2% w/w，浓度是ASNH-13水凝胶的100倍，是ASNH-19水凝胶的5倍）在对抗两种病原体的生物膜时完全无效。这些发现强调了水凝胶在治疗由细菌和真菌生物膜引起的复杂感染中的潜力。

在结果与讨论的另一部分，研究了水凝胶对真菌的强效抗菌活性及其对真菌生物膜的破坏能力。除了细菌感染，真菌定植也是伤口损伤的主要挑战。考虑到白色念珠菌（C. albicans）感染的高致病性，世界卫生组织（WHO）自2022年起将其列为真菌优先病原体列表中的“关键优先”病原体。因此，研究了优化后的水凝胶（ASNH-13和ASNH-19）对氟康唑耐药临床分离株C. albicans（C. albicans AB226和C. albicans AB399）的抗菌活性。在对抗这些真菌菌株时，水凝胶表现出完全杀灭能力，实现>5个对数的减少，仅在6小时内。对照水凝胶（ASH）不含金属纳米颗粒，未表现出任何抗真菌活性。随后，对水凝胶的快速抗菌机制进行了研究。与MRSA类似，对抗真菌菌株C. albicans AB226，水凝胶表现出膜破坏特性，通过PI通道的红色荧光（图S5B）证明。总体而言，优化后的水凝胶在对抗耐药细菌和真菌时表现出广谱抗菌活性，且不会对人类红细胞造成毒性。

与细菌生物膜类似，真菌生物膜也对传统抗真菌药物表现出抗性。特别是C. albicans细胞，能够穿透表皮和真皮，形成密集的生物膜，特别是在深层皮肤组织中。因此，还测试了水凝胶对真菌生物膜的破坏能力。水凝胶处理导致了真菌细胞数量的减少，约为1.5个对数（>95%）（图5A）。最后手段抗真菌药物两性霉素B表现出更高的活性，将细胞活力减少了>3个对数。然而，两性霉素B的细胞毒性是一个主要问题，限制了其广泛应用。类似地，市售的银基制剂Silverex?在对抗真菌生物膜时也表现出有限的活性。总体而言，这些发现强调了水凝胶在治疗由细菌和真菌生物膜引起的复杂感染中的强大能力。

在结果与讨论的另一部分，研究了水凝胶在消除混合生物膜中的表现，其效果优于最后手段抗生素和市售软膏。除了形成单菌种生物膜，C. albicans经常出现在慢性伤口感染、牙菌斑、囊性纤维化、胃肠道感染等混合微生物群落中。混合生物膜中的跨域相互作用增强了毒力，增加了药物抗性，并加剧了疾病严重的程度。在这些相互作用中，C. albicans和S. aureus之间的协同关系已被广泛研究，揭示了生物片的增加和致死性。我们的领先水凝胶同时具有抗菌和生物膜破坏特性，促使我们评估其对混合生物膜的效力。水凝胶处理显著减少了真菌和细菌的负担（图5B）。在真菌的情况下，ASNH-13和ASNH-19水凝胶表现出约1.5个对数的减少，而两性霉素B在高治疗浓度（>20 × MIC）下表现出约3个对数的减少。然而，两性霉素B无法减少真菌感染中的细菌数量。有趣的是，领先的水凝胶成功减少了MRSA的负担。ASNH-19表现出约1.5个对数的减少，而ASNH-13表现出>2个对数的减少（图5B）。最后手段抗生素万古霉素在高浓度（32 μg mL?1）下对细菌和真菌均无效果。没有任何抗生素能够同时杀死这两种生物，这证明了混合生物膜的复杂性（图5B）。此外，市售的银基制剂Silverex?在对抗混合生物膜时也表现出有限的效力，进一步强调了我们水凝胶配方的优越性能（图5B）。与传统抗生素和银基制剂不同，领先的水凝胶能够有效减少C. albicans和MRSA的微生物负担，突显了其应对混合生物膜复杂性的潜力。

为了进一步可视化混合生物膜的破坏，通过使用Calcofluor white、Syto-9和PI染色的共聚焦显微镜进行。Calcofluor white选择性地染色真菌细胞壁中的几丁质，并产生强烈的蓝色荧光。Syto-9染色活细胞和死细胞，并产生绿色荧光。另一方面，PI只能进入膜受损细胞并产生红色荧光。真菌细胞比细菌细胞大，因此在未处理生物膜中，两种生物表现出良好的共存。抗真菌药物两性霉素B只能杀死真菌细胞，强红色荧光与蓝色荧光细胞融合。然而，生物膜中仍然存在大量存活的细菌细胞（图S6）。另一方面，ASNH-13和ASNH-19水凝胶处理显著杀死了生物膜中的细胞，红色荧光来自细菌和真菌。同样，进行了混合生物膜的扫描电子显微镜（FESEM）分析。未处理的生物膜显示出两种微生物在簇中的共存，其中较小的细菌细胞粘附在较大的真菌细胞上。两种细胞均保持完整形态。然而，水凝胶处理破坏了生物膜，损害了其细胞膜结构，这是其膜靶向作用模式的结果（图5D）。ASNH-13水凝胶表现出更优的效力，伴随着丰富的细胞碎片。这一结果展示了这一类金属水凝胶处理混合生物膜相关感染的独特特性。

在结果与讨论的另一部分，研究了水凝胶在体内表现出的强生物相容性。为了进一步增强水凝胶的应用性，研究了其在小鼠模型中的生物相容性。具体来说，将水凝胶应用于小鼠背部皮肤，并观察7天内的炎症反应（图S7）。肉眼观察发现，水凝胶处理并未引发任何炎症反应，如皮肤红肿、刺激、抽搐、颤抖、流涎等（图S7）。在7天的治疗后，对皮肤组织进行了组织病理学分析（图S7）。ASNH-13和ASNH-19处理的皮肤组织显示出正常的表皮结构，由分层鳞状上皮细胞和角质层组成，没有炎性细胞浸润，与未处理对照组相似。真皮层显示出汗腺和皮脂腺（SG）以及毛囊（HF）。脂肪组织（AT）中含有脂肪细胞，其细胞核位于边缘。总体而言，水凝胶在体外和体内均表现出良好的生物相容性，证明了其作为伤口敷料材料的巨大潜力。

在结果与讨论的另一部分，研究了水凝胶在小鼠模型中的伤口感染治疗效果。在详细研究了体外抗菌活性后，评估了水凝胶在MRSA感染的小鼠模型中的体内疗效。所有动物在实验期间均保持正常状态。在14天内，体重的变化没有显著差异（图6A）。未处理组小鼠在第4、第7、第10和第14天的伤口收缩率分别为4.88%、12.74%、25.32%和50.54%（图6B和C）。ASNH-13表现出第4天的伤口收缩率为6.96%（p > 0.05），第7天为19.49%（p > 0.05），第10天为48.30%（p < 0.001）和第14天为74.06%（p < 0.001）（图6B和C）。每日应用ASNH-19 14天，显示出第4天的伤口收缩率为6.78%（p > 0.05），第7天为17.67%（p > 0.05），第10天为41.16%（p < 0.001）和第14天为67.36%（p < 0.001）（图6B和C）。市售的水凝胶Silverex?离子凝胶在第4、第7、第10和第14天的伤口收缩率分别为7.07%（p < 0.001）、21.51%（p < 0.001）、53.41%（p < 0.001）和77.78%（p < 0.001）（图6B和C）。所有治疗组均在第7天和第14天显示出细菌负担的显著减少（图6D和E）。在未处理对照组中，细菌数量在第7天增加至6.54 ± 0.44 CFU g?1。相比之下，含有AuNPs的水凝胶（ASNH-19）在第7天将细菌数量减少至5.68 ± 0.19（约90%减少；p < 0.05）（图6D）。另一方面，含有AgNPs的水凝胶（ASNH-13）表现出更优的效率，第7天将细菌活力减少约94%（p < 0.01），第14天减少>90%（图6D和E）。市售软膏Silverex?在第7天和第14天分别显示出约3个对数和约2个对数的细菌负担减少。较高的银浓度解释了其优越的活性。

组织切片显示，观察到的愈合过程与宏观评估一致（图7A）。在第7天对未处理对照组小鼠皮肤组织的组织病理学分析显示严重的多发性炎症。在第7天对治疗组（ASNH-13、ASNH-19和Silverex?）的皮肤组织进行显微镜检查，显示炎症反应显著减少，上皮化显著增加（p < 0.0001）。然而，与未处理对照组相比，胶原形成、成纤维细胞增殖、新生血管生成和肉芽组织形成的相关评分并不显著（p > 0.05）（图7B）。另一方面，第14天对治疗组（ASNH-13和Silverex?）的皮肤组织进行分析，显示出显著增加的肉芽组织形成（p < 0.01）、新生血管生成（p < 0.05 & p < 0.01）、成纤维细胞增殖（p < 0.01）、胶原形成（p < 0.0001）和上皮化（p < 0.0001）（图7C）。然而，ASNH-19的相关评分没有显著改善。尽管所有治疗组在感染组织中均表现出炎症减轻，未处理对照组仍显示出中度多发性炎症。研究显示，含有AuNPs和AgNPs的水凝胶在第10天和第14天显著增强伤口愈合效果。市售水凝胶在第7天显著改善伤口愈合，并在第10天和第14天保持效果。然而，Silverex?的潜在毒性及其对抗微生物生物膜的有限效力显示出我们配方的优越性。组织病理学分析显示，治疗组在第14天表现出显著增加的成纤维细胞增殖、胶原形成和上皮化，这加强了这些观察。

在结论部分，本研究强调了基于肽的金属纳米复合水凝胶作为解决耐药感染和混合生物膜相关问题的创新解决方案。利用阳光驱动、水相和原位合成方法，这些水凝胶避免了对有毒还原剂的需求，确保了生物相容性，同时在对抗多重耐药细菌和真菌方面表现出强大的广谱抗菌活性。这些金属水凝胶在破坏混合生物膜中的双重功效，包括消除单一菌种的真菌和细菌社区，凸显了其优于传统抗菌药物和市售制剂的优越性。此外，它们在促进伤口愈合中的显著能力，通过增强组织再生和减少微生物负担，进一步证明了其治疗潜力。它们的简单性、可扩展性和经济性使其成为下一代伤口敷料生物材料的有前途候选者。

在实验部分，首先列出了实验所需的试剂和材料。Fmoc-FF从LifeTein公司购买，Fmoc-RGD从SynPeptide公司购买，水解胶原蛋白（胶原蛋白I（液体）从大鼠尾部，CAS: 9007-34-5）从Guinama公司购买。所有凝胶剂在使用前未经进一步纯化。金（iii）氯化物三水合物（HAuCl4·3H2O）从Sigma-Aldrich公司购买，银硝酸盐（AgNO3）从Scharlau公司购买。S. epidermidis MTCC 3615、P. aeruginosa MTCC424和MRSA ATCC 33591从MTCC（昌迪加尔，印度）和ATCC（马里兰州，美国）分别购买。A. baumannii R674、E. coli R3336、K. pneumoniae R3934和P. aeruginosa R590从印度班加罗尔的国家精神卫生与神经科学研究所（NIMHANS）获得。真菌菌株（C. albicans AB226和C. albicans AB399）从印度班加罗尔的Anthem Biosciences公司获得。营养培养基和琼脂、YPD培养基和琼脂用于细菌培养。Tecan infinite pro系列M200微板阅读器用于测量光密度（OD）和荧光强度。

接下来，研究了肽基础溶液的制备。Fmoc-FF和Fmoc-RGD分别称重到一个瓶子中，并加入去离子水以获得20 mM的储备溶液。悬浮液通过超声波浴（HSt Powersonic 405-超声波浴）超声处理至少2小时。Fmoc-RGD的最终溶液未加入NaOH。为了获得Fmoc-FF的最终溶液，加入NaOH溶液（0.5 M），逐滴加入直到获得pH = 10.7的澄清溶液。pH通过HACH Sension PH 3 pH计测量。pH计使用pH 4、pH 7和pH 10缓冲液进行校准。

然后，研究了复合超分子水凝胶的形成。为了获得由Fmoc-FF、胶原蛋白和Fmoc-RGD形成的复合水凝胶，按照以下顺序混合，比例为3.5:5:1.5，最终有机材料的浓度为6.95 mg mL?1。

为了获得金属水凝胶，将Fmoc-FF、金和银的金属盐添加到肽基础溶液中，以诱导凝胶形成。对于Au3+的浓度为1.18–2.76 mg mL?1，Ag+的浓度为0.51–1.19 mg mL?1。对于浓度较低的样品，无法获得水凝胶。所有样品中Fmoc-FF的最终浓度均为10 mM。对金属盐进行了筛选，浓度分别为：

表
Cations | Metal | [Metallic salt] (mg mL?1) | [Metallic salt] (mM)
---|---|---|---
HAuCl4·3H2O | 0.04, 0.20, 0.39, 1.18, 1.97, 2.76 | 0.1, 0.5, 1, 3, 5, 7
AgNO3 | 0.02, 0.08, 0.17, 0.51, 0.85, 1.19 | 0.1, 0.5, 1, 3, 5, 7

为了获得由Fmoc-FF、Fmoc-RGD和胶原蛋白形成的复合金属水凝胶，混合顺序为Fmoc-FF、胶原蛋白、金和银的金属盐，最后加入Fmoc-RGD，以诱导凝胶形成，所有浓度因Fmoc-RGD的加入而pH值下降。

然后，研究了水凝胶的流变特性。使用Bohlin CS10控制应力流变仪（英国）进行机械性能表征，配备40 mm直径的板-板几何结构。将样品暴露在恒定频率和增加的剪切应力振幅（振幅扫描）下，并在恒定剪切应力振幅（τ0 = 1 Pa）和增加频率（0.1–10 Hz）下进行测试。从这些测量中，我们获得了存储模量（G′）和损耗模量（G′′）的数值，作为频率的函数，在线性粘弹性区域（LVR）内。三个不同的样品被测量以确保结果的统计显著性。每项指标的平均值和标准差在本文中提供。

然后，研究了水凝胶的透射电子显微镜（TEM）。干燥的凝胶在LIBRA 120 PLUS Carl Zeiss上进行研究。将水凝胶涡旋并稀释两次。将获得的纤维悬浮液滴在300网格铜网上，并用尿素乙酸盐负染色。样品在室温下干燥1小时。

然后，研究了水凝胶的环境扫描电子显微镜（ESEM）。将冷藏的肽水凝胶样品用ESEM进行研究，使用FEI Quanta 400配备的Peltier效应冷却台。

然后，研究了水凝胶的紫外-可见分光光度。将含有MNPs的水凝胶稀释至1:5的比例，使用MilliQ水进行测量。光谱在350 nm到700 nm的范围内扫描。吸收测量在Olis DSM17