通过工程改造的MTS-PUF-ALKBH3融合蛋白实现位点特异性的线粒体RNA N1-甲基腺苷去甲基化

《Advanced Science》：Site-Specific Mitochondrial RNA N1-Methyladenosine Demethylation via an Engineered MTS-PUF-ALKBH3 Fusion Protein

线粒体RNA N1-甲基腺苷（m1A）的CRISPR-free脱甲基编辑器MRD通过融合靶向线粒体的PUF蛋白与ALKBH3脱甲基酶，实现m1A在mRNA和tRNA的精准编辑。体外实验证实MRD能有效降低ND5、COX1及mt-tRNA-Lys的m1A水平，并影响ND5蛋白表达及细胞代谢。在体实验中，靶向mt-tRNA-Lys A9位的MRD导致小鼠严重免疫缺陷，表现为转录组异常和器官病理学改变。该工具为解析线粒体RNA修饰功能提供了新方法，并可能用于治疗相关疾病。

　　本研究围绕一种新型的、无需依赖CRISPR系统的线粒体RNA N1-甲基腺苷（m?A）去甲基化编辑工具展开，命名为MRD。该工具通过将线粒体定位的工程化PUF RNA结合蛋白与m?A去甲基酶ALKBH3融合构建。MRD能够在多种细胞系中实现对线粒体mRNA和tRNA中特定位置的m?A修饰进行精确去除，从而影响相关蛋白质的表达水平，同时表现出较低的脱靶效应。进一步的研究还表明，MRD能够系统地探索特定m?A修饰对细胞增殖、ATP生成、线粒体膜电位（MMP）和线粒体呼吸的影响。此外，在体内应用MRD，研究人员发现去除线粒体tRNA-Lys在A9位点的m?A修饰会导致小鼠严重的免疫缺陷表型，这通过转录组学和组织病理学分析得以验证。总体来看，这些发现表明MRD是一种适用于特定线粒体RNA m?A修饰编辑的多功能工具，为这些修饰的功能解析提供了新的化学生物学策略。

m?A修饰是线粒体RNA中一种广泛存在的可逆表观转录组修饰，它在调控多种细胞过程和疾病进展中发挥着重要作用。研究显示，线粒体ND5 mRNA中的m?A修饰能够导致强烈的线粒体核糖体停滞，而线粒体tRNA-Lys在A9位点的m?A修饰则是维持其“cloverleaf”结构所必需的。异常的m?A修饰已被与多种疾病如肌阵挛性小脑性癫痫伴肌红蛋白沉积（MERRF）、阿尔茨海默病和多种癌症相关联。尽管线粒体m?A在细胞和个体命运中的重要性日益受到重视，但对其具体功能的理解仍不如细胞质中的m?A深入，这主要归因于缺乏能够编辑线粒体RNA中特定位置m?A修饰的方法。

为了克服这一挑战，研究团队开发了一种基于PUF蛋白的线粒体RNA m?A去甲基化编辑工具。传统的CRISPR/Cas系统需要引导RNA（gRNA）来实现对特定RNA位点的编辑，但gRNA难以穿透线粒体的双层膜结构，因此限制了其在线粒体RNA修饰中的应用。而PUF蛋白作为一种无需gRNA的可编程RNA结合蛋白，能够通过其结构域识别特定的8个核苷酸序列，这种模块化的设计使得它能够被重新编程以针对不同的RNA位点。通过将PUF结构域与ALKBH3结合，并添加线粒体定位序列（MTS），研究团队构建了MRD编辑器。MRD在细胞中能够高效地去除目标线粒体mRNA和tRNA中的m?A修饰，并且表现出较低的脱靶效应。

为了验证MRD在体内和体外对线粒体mRNA的m?A修饰去除效果，研究人员选择了线粒体tRNA-Lys在A9位点，该位点在小鼠线粒体tRNA中具有最高的m?A修饰水平。通过将MRD编辑器引入小鼠基因组，研究团队构建了TK9-MRD小鼠模型。结果显示，TK9-MRD小鼠在出生后两周内死亡率显著升高，这表明m?A修饰的去除可能影响了免疫系统的发育。通过转录组学和组织病理学分析，研究人员进一步确认了这些表型的变化，发现这些小鼠的脾脏和造血系统存在明显的异常，如淋巴细胞数量减少、红白髓边界模糊等，这些变化与免疫功能受损密切相关。

为了排除这种高死亡率是否由随机整合引起的，研究团队利用了Tet-On系统，构建了Dox诱导的TK9-DIP-MRD小鼠模型。结果显示，在未接受Dox处理的情况下，TK9-DIP-MRD小鼠的存活率与野生型小鼠相似，说明死亡率主要由MRD诱导的m?A修饰去除所致。此外，Dox诱导的TK9-DIP-MRD小鼠也表现出与TK9-MRD相似的脾脏病理变化，进一步支持了m?A修饰在线粒体RNA中的重要性。研究还发现，这些小鼠的多个器官表现出与线粒体功能障碍相关的病理特征，如心肌肥厚、肝细胞退化伴脂质沉积、肺泡增厚和肾小管上皮损伤等。这些发现表明，线粒体tRNA中的m?A修饰可能在维持正常的生理功能和防止疾病进展中起着关键作用。

为了进一步探讨MRD在体外对线粒体mRNA的m?A修饰去除效果，研究人员选择了ND5 mRNA中已知的m?A修饰位点A13743，并通过工程化的PUF结构域设计了针对该位点的MRD编辑器。通过RT-1306、SELECT和m?A-RIP-qPCR等方法评估m?A修饰的变化，结果表明MRD能够显著降低ND5 A13743位点的m?A水平，并且在蛋白表达水平上表现出相应的上调。这种变化与先前研究中关于m?A修饰能够阻止基因翻译的结论一致。此外，研究团队还对COX1 mRNA中的低丰度m?A修饰位点A7375进行了测试，虽然RT-1306在该位点的灵敏度较低，但SELECT和m?A-RIP-qPCR证实了m?A水平的显著下降，并且COX1蛋白表达也相应减少。

为了进一步验证MRD对不同细胞类型中线粒体mRNA的m?A修饰去除效果，研究人员将MRD应用于HepG2细胞中的ND5和COX1 mRNA。结果显示，MRD在这些细胞中同样能够显著降低m?A水平，并影响蛋白表达。这些发现表明，MRD能够实现对线粒体mRNA中特定位置的m?A修饰的精确去除，并在不同细胞类型中调控基因翻译。

此外，研究团队还评估了MRD的脱靶效应，以确保其在去除特定m?A修饰的同时不会引起广泛的非特异性修饰。通过m?A-RIP-seq分析，研究发现MRD在靶向ND5 A13743位点时，能够显著降低该位点的m?A水平，而其他超过12900个检测位点中仅有约1000个出现m?A修饰的减少，表明其脱靶效应较小。通过RNA-seq分析，研究团队进一步发现MRD在去除m?A修饰后，对转录组的影响较为有限，仅有少数基因表现出显著的表达变化，这进一步支持了MRD的高特异性。

MRD的脱靶效应评估不仅限于体外实验，还扩展到体内应用。通过RNA-seq分析，研究人员发现MRD在去除mt-tRNA-Lys A9位点的m?A修饰后，仅影响了少数基因的表达，这表明其在体内同样具有较高的特异性。同时，研究人员还观察到这些小鼠的脾脏和造血系统存在明显的病理变化，如淋巴细胞数量减少、造血细胞和单核细胞减少等，进一步确认了m?A修饰在维持免疫系统发育中的重要性。

此外，MRD还被用于评估m?A修饰对细胞增殖和线粒体功能的影响。研究发现，去除ND5 A13743和COX1 A7375位点的m?A修饰会导致ATP合成下降，并且线粒体膜电位（MMP）降低，这表明细胞代谢发生了向糖酵解的转变。而去除MT-TK9和MT-TK58位点的m?A修饰则会增强ATP生成，并且线粒体膜电位上升，这可能与线粒体呼吸功能的增强有关。这些结果表明，特定m?A修饰的去除能够对细胞增殖、ATP生成、MMP维持和线粒体呼吸产生不同的影响，强调了RNA修饰在细胞生理和线粒体功能调控中的作用。

为了进一步探索m?A修饰在体内对免疫系统的影响，研究人员利用Dox诱导的TK9-DIP-MRD小鼠模型，发现这些小鼠的多个器官表现出与线粒体功能障碍相关的病理特征。例如，心肌肥厚、肝细胞退化伴脂质沉积、肺泡增厚和肾小管上皮损伤等。此外，研究人员还发现这些小鼠的肌肉组织中存在红纤维（RRF），这是MERRF的标志性特征。脑组织苍白也是观察到的现象，这与线粒体脑肌病的病理特征相符，类似于MELAS、MERRF和Kearns-Sayre综合征等疾病的特征。这些发现表明，线粒体tRNA中的m?A修饰可能在维持正常的生理功能和防止疾病进展中起着关键作用。

尽管MRD具有良好的特异性，但其在体内应用的效率仍有待进一步优化。研究团队指出，进一步提高PUF介导的RNA结合亲和力，以及发现或设计更具活性的m?A去甲基酶结构域，是实现其在体内应用所必需的。此外，研究还表明，MRD能够作为治疗线粒体疾病的工具，但其在疾病模型中的疗效仍需进一步验证。

总体来看，本研究不仅揭示了MRD作为线粒体RNA m?A去甲基化编辑工具的潜力，还为线粒体表观转录组学的机制研究提供了新的途径。通过MRD编辑器和相应的动物模型，研究团队为线粒体生物学的基础研究和治疗策略的开发奠定了基础。这些成果表明，RNA修饰在细胞生理和病理中的重要性正在被逐步揭示，为未来的科学研究和临床应用提供了新的方向。