EM2是一种天然产物，可作为MST1/2激酶的激活剂，通过激活Hippo通路来抑制非小细胞肺癌的发展

《Advanced Science》：EM2, a Natural Product MST1/2 Kinase Activator, Suppresses Non-Small Cell Lung Cancer via Hippo Pathway Activation

本研究发现EM2可通过直接靶向激活MST1/2激酶，增强Hippo信号通路，抑制非小细胞肺癌（NSCLC）细胞增殖、迁移和侵袭，并减少YAP核转位。体内实验证实EM2有效抑制肿瘤生长，且其作用依赖MST1/2活性。该研究为NSCLC治疗提供了新型靶向MST1/2的天然产物候选药物EM2。

　　肺癌是全球发病率和死亡率最高的癌症类型，其中约85%属于非小细胞肺癌（NSCLC）。尽管近年来在治疗策略上取得了显著进展，但传统的放疗和化疗在治疗效果上仍显不足，凸显了开发更有效治疗手段的迫切需求。MST1和MST2（统称为MST1/2）作为哺乳动物Hippo信号通路的核心组成部分，其功能紊乱已被证实与NSCLC的进展密切相关，这使得MST1/2成为一种潜在的治疗靶点。然而，目前尚未发现具有高选择性和高疗效的MST1/2激活剂。在本研究中，通过计算机辅助虚拟筛选结合细胞实验，研究人员识别出EM2作为一种具有潜力的MST1/2结合候选物。后续的实验验证显示，EM2能够显著抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭行为，其作用机制是通过直接靶向MST1/2并增强其激酶活性，从而激活Hippo信号通路，并减少下游效应因子YAP向细胞核的转移。在体内异种移植模型和类器官模型中，EM2均显示出对NSCLC肿瘤生长的显著抑制作用。综上所述，本研究不仅再次确认了MST1/2作为NSCLC的可行治疗靶点，还提供了有力的实验证据支持EM2作为一种高效且有前景的抗癌药物。

Hippo信号通路是一条高度保守的激酶级联反应，其核心由MST1/2、LATS1/2和YAP等组成，对细胞增殖、凋亡、衰老以及肿瘤微环境具有重要的调控作用。MST1/2作为该通路的关键上游调节因子，其功能异常与多种癌症的发生和发展密切相关。NSCLC中，MST1/2的表达下调往往伴随着肿瘤进展的加速，因此，针对MST1/2的干预策略在NSCLC治疗中具有重要价值。近年来，天然产物在抗癌药物的发现和开发中发挥了重要作用，许多临床使用的抗癌药物均源自自然来源，突显了其在肿瘤治疗中的不可替代性。植物提取物因其丰富的生物活性成分和较低的毒性，成为抗癌药物研发的重要方向。EM2是从一种传统中药植物中分离出的低分子化合物，已被证实对肝癌具有显著的抗肿瘤活性，通过抑制自噬流发挥其作用。此外，EM2与表阿霉素的联合使用在体外和体内实验中均表现出增强的细胞毒性及抗肿瘤效果。这些研究结果表明，EM2在抗癌治疗中具有广阔的应用前景。

为了探索EM2在NSCLC治疗中的作用机制，本研究构建了一个包含1120种天然化合物的化合物库，并利用虚拟筛选技术进行初步筛选。通过MTT实验评估细胞活力，筛选出具有较高潜力的化合物后，进一步进行分子对接、拉下实验（pull-down）以及激酶活性实验（如ADP-Glo检测），最终确认EM2为MST1/2的高亲和力结合候选物。分子对接分析显示，EM2与MST1的结合口袋存在多个关键氨基酸残基，如Glu202、Gly252、Asn253、Leu255、Asp266和Thr286。分子动力学模拟进一步证实了EM2与MST1形成的复合物具有良好的动态稳定性。此外，通过共孵育实验，EM2能够竞争性地阻止EM2-P在A549细胞中的标记，表明其与MST1存在直接的结合关系。拉下实验和CETSA（细胞热稳定性）实验进一步验证了EM2与MST1的直接相互作用，显示EM2能够增强MST1的热稳定性，减少其温度依赖性的降解。DARTS实验则表明，EM2可以保护MST1免受蛋白酶降解，形成稳定的药物-蛋白复合物。微尺度热泳实验和等温滴定量热法（ITC）进一步揭示了EM2与MST1之间的剂量依赖性结合亲和力，证实了其高亲和力特性。更重要的是，EM2的浓度与MST1/2激酶活性之间存在显著的正相关关系，表明EM2能够通过激活MST1/2激酶来发挥其抗肿瘤作用。

在细胞层面，EM2对NSCLC细胞的抑制作用体现在多个方面。通过MTT实验发现，EM2能够以剂量和时间依赖性方式显著抑制NSCLC细胞的增殖。此外，克隆形成实验和EdU检测进一步验证了EM2对细胞增殖的抑制作用。EM2还能够显著减少NSCLC细胞的迁移和侵袭能力，这一效果通过转室迁移和侵袭实验得到证实。值得注意的是，EM2对正常细胞系如HBE和HUVEC无明显毒性，这表明其具有良好的选择性，可能减少对健康组织的副作用。进一步的流式细胞术分析显示，EM2能够使NSCLC细胞在G1期发生阻滞，而SA-β-Gal染色则证实了其诱导细胞衰老的能力。Western blot分析还发现，EM2能够降低Cyclin D1和CDK4的表达水平，同时增加p53、p21和p16的蛋白水平，这些结果均支持EM2通过细胞周期阻滞和细胞衰老机制抑制NSCLC细胞的生长。

为了深入探究EM2的抗肿瘤机制，研究团队还进行了Hippo信号通路相关分子机制的分析。通过RNA测序技术，研究发现EM2处理后，A549细胞中约有3145个基因上调，2535个基因下调。KEGG富集分析进一步揭示了Hippo信号通路的显著富集。RNA-seq数据还显示，EM2能够抑制Hippo通路核心成分的表达，包括YAP等下游效应因子。此外，EM2能够诱导MST、LATS、YAP和TAZ的磷酸化，并且这些磷酸化水平随EM2浓度的增加而升高。同时，EM2还能显著降低CTGF和CYR61的蛋白和mRNA水平，这表明其通过激活Hippo信号通路，抑制了NSCLC细胞的增殖并诱导了细胞衰老。这些结果不仅揭示了EM2在NSCLC治疗中的作用机制，也为Hippo信号通路的激活提供了新的实验依据。

在体内实验中，研究人员构建了异种移植肿瘤模型，以评估EM2的抗肿瘤效果。结果表明，EM2能够显著抑制肿瘤的生长，且对小鼠的体重和主要器官（如心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）未造成明显的组织损伤或形态学变化，这进一步证明了EM2的安全性。免疫组化（IHC）分析显示，EM2处理组中Ki67、YAP、CTGF和CYR61的表达水平显著降低，表明其对肿瘤细胞增殖和相关信号通路的抑制作用。Western blot实验也验证了EM2在体内能够激活Hippo信号通路，提高MST1、LATS1/2和YAP的磷酸化水平，并降低CTGF和CYR61的表达。这些体内实验结果与体外实验结果一致，进一步支持EM2作为NSCLC治疗药物的潜力。

为了验证MST1/2在EM2抗肿瘤作用中的关键性，研究团队还联合使用了MST1/2激酶抑制剂XMU-MP-1。结果显示，XMU-MP-1能够逆转EM2对NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，这表明EM2的抗肿瘤效果依赖于MST1/2的激活。同时，XMU-MP-1也能够逆转EM2在体内对肿瘤生长的抑制作用，进一步证明了MST1/2在EM2抗肿瘤机制中的核心地位。此外，EM2对来源于患者的NSCLC类器官表现出显著的抗肿瘤活性，其IC50值在0.54至1.15 μM之间，显示出对NSCLC细胞的高效抑制作用。IF实验显示，EM2能够显著降低Ki67、YAP、CTGF和CYR61的表达水平，而XMU-MP-1则能够逆转这种抑制效果，表明EM2的抗肿瘤作用确实依赖于MST1/2的激活。

综上所述，EM2通过激活MST1/2，进而增强Hippo信号通路的活性，抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并减少YAP的核转移，从而显著抑制肿瘤的生长。该研究不仅揭示了EM2在NSCLC治疗中的作用机制，还为开发新的抗癌药物提供了理论依据和实验支持。然而，研究仍存在一定的局限性，例如EM2在动物模型中的药代动力学特性尚未完全明确，其在MST1/2上的具体结合位点仍需进一步验证。此外，研究尚未比较EM2与其他已知YAP抑制剂的疗效差异，这可能为后续研究提供方向。总体而言，EM2作为一种新型的MST1/2激活剂，展现出在NSCLC治疗中的巨大潜力，值得进一步深入研究和开发。